屋尘螨诱导BEAS-2B细胞及细胞外囊泡相关miRNA谱的差异性改变：针对IL-4应答的靶向分析

《Cells》：House Dust Mite Induces Distinct Cellular and Extracellular Vesicle-Associated miRNA Signatures in BEAS-2B Cells: Targeted Analysis of IL-4 Responses

　　

摘要专业翻译 气道上皮细胞通过变应原感知、2型细胞因子应答及细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）介导的细胞间通讯，主动参与调节过敏性哮喘。微小RNA（microRNA，miRNA）是上皮炎症和重塑的重要转录后调控因子；然而，变应原暴露在多大程度上差异性改变细胞内及EV相关miRNA谱仍未完全阐明。本研究在BEAS-2B支气管上皮细胞及其EV富集组分中表征了屋尘螨（house dust mite，HDM）暴露诱导的miRNA应答，并在白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）刺激后进一步检测了选定的HDM应答性miRNA。BEAS-2B细胞接受HDM提取物或IL-4处理72 h。采用差速离心法从条件培养基中分离EV富集制备物，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析、EV相关标志物免疫印迹及摄取实验进行表征。采用NanoString nCounter Human v3 miRNA芯片对对照及HDM处理样本进行细胞内及EV相关miRNA全谱分析，随后通过qRT-PCR对选定候选miRNA进行验证。HDM应答性miRNA随后在IL-4处理细胞及相应EV相关RNA中通过靶向qRT-PCR进行评估。对差异表达miRNA进行通路富集分析。HDM暴露诱导了细胞内miRNA景观的显著重塑，在BEAS-2B细胞中鉴定出39个差异表达miRNA。相比之下，EV相关RNA表现出较小但独特的差异表达miRNA集合，包括miR-612、miR-302d-3p、miR-125b-5p和miR-15a-5p。值得注意的是，miR-15a-5p在细胞内和EV相关RNA中呈现相反的变化方向，凸显了不同区室间miRNA丰度的差异。qRT-PCR独立支持了多个EV相关候选miRNA，包括miR-612、miR-302d-3p、miR-15a-5p和miR-125b-5p。通路分析将HDM应答性miRNA与细胞周期调控、p53信号通路、FoxO信号通路、自噬及炎症通路相关联。靶向qRT-PCR分析显示，与各自未处理对照相比，多个选定的HDM应答性miRNA在IL-4刺激后表达降低，表明在两种刺激范式下多个候选miRNA呈现不同的方向性应答。HDM暴露与BEAS-2B支气管上皮模型中独特的细胞内及EV相关miRNA应答相关联。细胞内与EV相关miRNA谱之间的有限重叠表明，特定miRNA在细胞内和EV区室中以不同水平存在。此外，多个HDM应答性miRNA在IL-4刺激后呈现差异性应答，支持变应原和细胞因子信号对miRNA的上下文依赖性调控。上述发现将EV相关miRNA确定为未来在上皮细胞间通讯和过敏性气道炎症背景下开展机制研究的候选分子。

论文解读

一、研究背景与科学问题

气道上皮长期以来被视为被动物理屏障，但近年研究证实其是主动的免疫感知界面。持续暴露于吸入性变应原、污染物及微生物产物的呼吸道上皮在调控气道免疫应答中发挥核心作用。激活后，上皮细胞可发生屏障破坏和黏液过度分泌，释放胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白细胞介素-33（interleukin-33，IL-33）和IL-25等趋化因子及上皮警报素，通过激活树突状细胞、2型固有淋巴样细胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2s）、Th2细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞及气道结构细胞，启动并放大2型气道炎症。

屋尘螨（house dust mite，HDM）是过敏性哮喘中最具临床相关性的气传变应原之一，其含有蛋白酶和病原体相关分子模式，可损伤上皮屏障并激活固有免疫通路。与单一细胞因子刺激不同，HDM作为复合变应原源性刺激，可同时激活上皮屏障破坏、钙信号、Toll样受体激活、蛋白酶激活受体、氧化应激应答及警报素释放等多条通路。相比之下，IL-4和IL-13等2型细胞因子主要通过IL-4受体信号传导并激活STAT6依赖性转录程序，调控IgE生物学、杯状细胞化生、黏液产生及骨膜素表达等T2-high哮喘特征。因此，考察HDM变应原应答性miRNA在IL-4刺激下的行为，有助于判断所选miRNA应答是否在复合变应原暴露与经典2型细胞因子信号之间共享。

在细胞内miRNA活性之外，细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）已成为气道细胞间通讯的重要介质。气道上皮来源的EV携带miRNA、mRNA、蛋白质、脂质及危险相关分子模式，可影响邻近上皮细胞以及巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞和淋巴细胞。EV相关miRNA在哮喘中尤为值得关注，因其既可充当疾病活动度的生物标志物，也可作为细胞间信号传导的介质。然而，EV相关miRNA组分究竟是简单反映细胞内miRNA丰度，还是在细胞外囊泡区室内呈现选择性、刺激依赖性富集，仍不清楚。此外，直接比较变应原暴露后细胞内与EV相关miRNA应答的研究相对有限，变应原应答性miRNA在2型细胞因子刺激下是否呈现相似调控也尚未明确。基于上述问题，本研究旨在BEAS-2B支气管上皮细胞模型中，利用全谱NanoString分析、qRT-PCR验证及生物信息学通路分析，表征HDM暴露诱导的细胞内和EV相关miRNA应答，并作为次要靶向分析，考察选定HDM应答性miRNA在IL-4刺激后的表达变化。

二、主要技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：利用永生化人支气管上皮细胞系BEAS-2B（ATCC来源）作为体外模型；采用差速离心结合超速离心法从条件培养基中分离EV富集制备物；通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA，NanoSight NS300系统）及EV标志物免疫印迹（CD63、TSG101、Syntenin-1，并检测内质网蛋白GRP94和钙联蛋白以排除污染）对EV进行表征；采用ExoGlow膜EV标记试剂盒结合共聚焦显微镜评估EV摄取；使用NanoString nCounter Human v3 miRNA表达芯片（覆盖827个人类miRNA）进行全谱miRNA分析，以nSolver 4.0软件进行数据标准化和差异表达分析；采用miScript SYBR Green PCR Kit进行qRT-PCR独立验证；利用DIANA miRPath v4.0（TarBase v8.0数据库）进行KEGG通路富集分析；利用miRTarBase v9.0鉴定实验验证的miRNA靶基因；并在公开的支气管上皮转录组数据集GSE158752（含17例健康对照、25例轻中度哮喘和25例重度哮喘患者）中评估靶基因表达。

三、研究结果

3.1 BEAS-2B来源细胞外囊泡的分离与表征

透射电子显微镜显示，从对照和HDM处理BEAS-2B细胞条件培养基中分离的EV制备物呈现典型的圆形或杯状形态。纳米颗粒跟踪分析显示，与对照相比，HDM和IL-4处理细胞来源的制备物中颗粒浓度增加，而各组间平均和众数粒径保持可比。免疫印迹检测到EV相关蛋白TSG101、Syntenin-1和CD63（含异质性糖基化CD63模式），而未检测到内质网相关蛋白GRP94和钙联蛋白，确认了EV制备物的纯度和身份。荧光标记EV与受体BEAS-2B细胞共孵育24 h后，观察到点状和核周相关荧光，证实BEAS-2B来源EV可被受体上皮细胞摄取。

3.2 HDM在BEAS-2B细胞中诱导独特的miRNA谱

NanoString miRNA芯片分析显示，与对照细胞相比，HDM暴露72 h导致39个miRNA显著差异表达，其中15个上调、24个下调。无监督层次聚类可区分HDM处理组和对照组样本。KEGG通路富集分析将差异表达miRNA与细胞周期调控、p53信号通路、FoxO信号通路、细胞衰老和自噬等通路相关联。

3.3 HDM在BEAS-2B细胞外囊泡中诱导独特的miRNA谱

对相应BEAS-2B来源EV相关RNA进行NanoString分析，鉴定出较小但独特的差异表达miRNA集合：6个上调（miR-612、miR-302d-3p、miR-873-3p、miR-1246、miR-15a-5p和miR-125b-5p）和2个下调（miR-494-3p和miR-21-5p）。层次聚类可分离HDM处理组和对照组。通路分析将EV相关miRNA与炎症、细胞存活和应激反应等通路相关联。

3.4 BEAS-2B细胞内与EV相关miRNA的比较分析

维恩图分析显示，在细胞内RNA中鉴定的39个差异表达miRNA和EV相关RNA中鉴定的8个差异表达miRNA中，仅miR-15a-5p为两个数据集共享。值得注意的是，miR-15a-5p在HDM暴露后呈现相反方向变化：在细胞内RNA中降低，在EV相关RNA中升高。主成分分析显示细胞内和EV相关RNA数据集中HDM处理组与对照组均清晰分离。

3.5 HDM处理BEAS-2B细胞及EV相关RNA中NanoString鉴定miRNA的qRT-PCR验证

qRT-PCR在HDM处理BEAS-2B细胞总RNA中确认了miR-1915-3p和miR-126-3p的显著上调，与NanoString结果一致；miR-19a-3p和miR-503-5p呈同方向变化但未达统计学显著性。在EV相关RNA中，qRT-PCR确认了miR-612、miR-302d-3p、miR-15a-5p和miR-125b-5p的显著上调，与NanoString结果一致；但miR-1246在qRT-PCR中未显示显著变化。

3.6 HDM应答性EV相关miRNA在BEAS-2B总细胞RNA中的评估

在总细胞RNA中对miR-612、miR-302d-3p、miR-1246、miR-15a-5p和miR-125b-5p进行qRT-PCR检测，均未显示HDM处理后的显著变化，进一步支持EV相关miRNA丰度不直接反映细胞内表达水平。

3.7 BEAS-2B细胞及EV相关RNA中IL-4应答的靶向分析

在EV相关RNA中，IL-4处理导致miR-302d-3p和miR-15a-5p显著降低，而miR-612、miR-1246和miR-125b-5p呈下降趋势但未达统计学显著性。在总细胞RNA中，miR-612、miR-302d-3p、miR-1246和miR-15a-5p在IL-4处理后显著降低，miR-125b-5p呈非显著性降低。此外，miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-148b-3p、miR-181a-5p、miR-503-5p、miR-1234-3p和miR-4454在IL-4处理后均显著降低，而miR-99a-5p、miR-191-5p、miR-423-3p、miR-424-5p、miR-1915-3p和miR-4284未显著改变。

3.8 GSE158752数据集中的靶基因评估

在独立支气管上皮RNA测序数据集GSE158752中，HDM处理BEAS-2B细胞中下调的miR-25-3p、miR-181a-5p和miR-34a-5p对应的靶基因BAX、MCL1和RUNX2在轻中度和/或重度哮喘组中表达升高。HDM暴露后上调的miR-19b-3p、miR-106b-5p、miR-590-5p和miR-1234-3p的验证靶基因STAT3在重度哮喘组中显著降低。EV相关RNA中下调的miR-494-3p和miR-21-5p的靶基因ARNTL、IRAK1、TLR2、ZEB1和ZEB2在重度哮喘组中表达升高。EV相关RNA中上调的miR-612、miR-15a-5p和miR-125b-5p的靶基因AKT2、HMGA2、SNAI1、WNT3A和YAP1在重度哮喘组中表达降低。

四、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，本研究通过全谱NanoString分析在BEAS-2B支气管上皮细胞模型中鉴定了HDM暴露诱导的独特细胞内和EV相关miRNA应答。HDM诱导了大量细胞内miRNA表达改变，而EV相关RNA中仅检测到有限子集的差异表达，表明EV相关miRNA丰度并非简单镜像细胞内miRNA水平，支持EV货物组成受选择性及潜在调控性机制影响的观点。miR-15a-5p在细胞内和EV区室间的相反变化方向尤为值得关注，提示EV相关miRNA丰度可能不反映细胞内表达，支持进一步研究其在上皮细胞间通讯中的作用。经qRT-PCR验证的miR-612、miR-302d-3p、miR-15a-5p和miR-125b-5p被确定为HDM暴露后突出的EV相关miRNA候选分子。IL-4靶向分析显示所选miRNA以表达降低为主，与HDM暴露后的应答模式不同，支持变应原和细胞因子驱动的上皮信号可能差异性调控miRNA表达。生物信息学分析将HDM应答性miRNA与细胞周期调控、p53信号、FoxO信号、自噬、细胞衰老和炎症反应等通路相关联。GSE158752数据集分析为部分miRNA-靶基因关系提供了跨数据集支持性证据。研究局限性包括：仅在永生化BEAS-2B细胞系中进行、样本量相对有限（n=6/组）、未直接评估特定EV相关miRNA的功能性转移及下游生物学效应、未考察处理诱导的EV蛋白货物改变、IL-4分析仅限于选定miRNA且为单一浓度和时间点。

研究结论：全谱miRNA分析在BEAS-2B支气管上皮细胞模型中鉴定了HDM暴露诱导的独特细胞内和EV相关miRNA应答。HDM诱导了细胞内miRNA景观的广泛重塑，而EV相关RNA呈现较小但独特的差异表达miRNA集合，凸显了细胞内与EV相关miRNA区室间的差异。在鉴定出的候选分子中，miR-612、miR-302d-3p、miR-15a-5p和miR-125b-5p经qRT-PCR独立支持，成为HDM暴露后突出的EV相关miRNA。靶向分析进一步显示多个HDM应答性miRNA在IL-4刺激后呈现独特表达模式，支持所选上皮miRNA的刺激依赖性调控。上述发现将EV相关miRNA确定为变应原诱导上皮通讯研究中值得进一步探讨的候选分子，并为未来在分化原代人气道上皮细胞模型中的机制研究和验证奠定了基础。