大肠杆菌rpiAB突变体对抗生素的高敏感性与deo操纵子参与假想的核糖-5-磷酸无效循环相关

《Cells》：High Sensitivity of the rpiAB Escherichia coli Mutants to Antibiotics Is Associated with the Participation of the deo-Operon in a Hypothetical Ribose-5-Phosphate Futile Cycle

　　

研究人员前期证实，戊糖磷酸途径中核糖-5-磷酸生物合成的破坏会提高大肠杆菌（Escherichia coli）对广谱抗生素的敏感性，且该敏感性可通过deoB基因的缺失得以抑制。本研究表明，抗生素敏感性同样可被apt基因的缺失所抑制；apt基因与deoBD基因共同构成嘌呤碱基摄取的补救途径（salvage pathway）。研究人员提出，在rpiAB突变体中，这些基因与负责磷酸核糖焦磷酸（PRPP）合成的prs基因共同参与一个无效循环（futile cycle），将ATP转化为AMP和焦磷酸（PP_i）。针对apt和deoBD基因缺失的遗传互补实验数据，结合rpiAB突变体细胞中ATP水平的恢复，支持了该假想的核糖-5-磷酸无效循环模型。

**一、研究背景与目的**

抗生素耐药性问题在临床和社会重要病原菌中日益严峻，近年研究致力于探索抗生素对细菌代谢的非特异性效应，以寻求降低细胞对药物适应潜力的新策略。研究人员前期已证实，戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway, PPP）中核糖-5-磷酸（R5P）生物合成的破坏可显著提高大肠杆菌（Escherichia coli）对广谱抗生素的敏感性，且该敏感性可通过deoB基因缺失得以抑制。deoB编码磷酸戊糖变位酶，催化核糖-1-磷酸（R1P）与R5P之间的转化，提示核苷分解代谢是细胞内R5P的另一重要来源。大肠杆菌的核苷降解由deo操纵子编码的酶完成，该操纵子包含两个功能部分：deoC（脱氧核糖醛缩酶）与deoA（胸苷磷酸化酶）负责嘧啶脱氧核苷分解，受P₁、P₂启动子控制；deoB与deoD（嘌呤核苷磷酸化酶）负责嘌呤核苷分解，受独立的P₃启动子调控，该启动子由嘌呤核糖核苷肌苷和鸟苷诱导，不受DeoR和CytR阻遏物直接控制。本研究旨在系统探讨deo操纵子各基因及嘌呤补救途径基因对ΔrpiAB突变体抗生素敏感性的影响，并检验假想的R5P无效循环模型。

**二、研究内容与总体发现**

研究人员发现，与deoB相似，deoD基因缺失同样可抑制ΔrpiAB突变体对抗生素的高敏感性，而deoC缺失无此效应。更为重要的是，编码腺嘌呤磷酸核糖转移酶的apt基因缺失亦能抑制抗生素敏感性并提高细胞内ATP水平。遗传互补实验表明，导入野生型deoB、deoD或apt等位基因可逆转上述抑制效应。基于这些遗传证据，研究人员提出由deoBD、apt与prs（编码核糖磷酸焦磷酸激酶）共同构成的假想R5P无效循环（RFC）：R5P经Prs催化生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP）并伴随ATP转化为AMP；AMP经脱磷酸生成腺苷，腺苷经DeoD分解为腺嘌呤和R1P；R1P经DeoB重新转化为R5P；腺嘌呤亦可与PRPP经Apt重新合成AMP。该循环每运行一轮将一分子ATP转化为AMP和焦磷酸（PP_i），导致ATP池持续消耗，进而介导突变体的抗生素高敏感表型。

**三、关键技术与方法**

研究人员使用大肠杆菌MG1655野生型及系列突变体菌株（菌株来源于KEIO文库，经P1噬菌体转导构建三重突变体，卡那霉素抗性盒经pCP20质粒去除并以PCR确认缺失）；应用Bioscreen C自动生长曲线仪监测细菌生长；按临床和实验室标准研究所（CLSI）规范开展时间-杀菌试验评估抗生素敏感性；利用pUC19表达载体对deoB、deoD和apt基因缺失进行遗传互补；以热酚法提取RNA并采用RT-qPCR检测基因表达（以rpoC为内参基因，Pfaffl法计算变化倍数）；以发光法试剂盒测定细胞内ATP水平；以分光光度法试剂盒测定PRPP合成酶（PRPP-S）活性；数据经单因素方差分析（ANOVA）及Tukey校正进行统计检验。

**四、研究结果**

**3.1 ΔrpiAB突变体中deo操纵子表达的激活**

外源嘌呤核糖核苷（腺苷、鸟苷）抑制ΔrpiAB突变体生长，而嘌呤脱氧核苷（脱氧腺苷、脱氧鸟苷）及含氮碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤）则