Panduratin A与Pinostrobin减轻氨基化聚苯乙烯微塑料诱导的肾损伤：体外与体内研究证据

《Microplastics》：Panduratin A and Pinostrobin Mitigate Aminated Polystyrene Microplastic-Induced Renal Injury: Evidence from In Vitro and In Vivo Studies

　　

聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）是新兴的环境污染物，与包括肾损伤在内的人体健康不良效应相关。然而，针对微塑料诱导的肾毒性的保护策略仍然有限。本研究利用人肾近端小管上皮细胞（HK-2）和C57BL/6NJcL小鼠模型，探讨了Panduratin A（PA）和Pinostrobin（PIN）对聚苯乙烯微塑料诱导的肾脏损伤的肾保护潜力。采用动态光散射（DLS）和zeta电位测量对三种类型颗粒（普通PS、PS-COOH和PS-NH₂）进行表征。在去离子水中，PS-NH₂的zeta电位负值最小；然而，在含胎牛血清（FBS）的培养基中，这种差异不再被观察到，因为此时PS-NH₂的多分散指数（PDI）增幅最大，表明其聚集行为有所不同。当HK-2细胞暴露于50 μg/mL剂量的三种颗粒时，与普通PS或PS-COOH相比，PS-NH₂表现出更高的细胞摄取和细胞毒性，表现为乳酸脱氢酶（LDH）释放增加和细胞内蓄积增多。因此选择PS-NH₂进一步研究其产生活性氧（ROS）、诱导细胞凋亡的能力，并评估PA和PIN的保护作用。PA或PIN处理均可减少HK-2细胞中PS-NH₂的蓄积、ROS形成和细胞凋亡。在动物研究中，小鼠经口给予PS-NH₂，剂量为0.4 mg/天，持续28天。该暴露导致早期近端小管损伤，表现为轻度组织病理学改变，尽管体重、摄食量、血尿素氮或肌酐均无明显变化。在PS-NH₂暴露前1小时每日一次给予PA（25 mg/kg体重）或PIN（40 mg/kg体重）预处理，可减轻肾脏组织病理学损伤，其中PIN的作用优于PA。总之，氨基化聚苯乙烯微塑料在体外和体内模型中均具有肾毒性，而Panduratin A和Pinostrobin可减轻这些不良效应，其机制可能涉及调节细胞摄取和细胞内应激通路。

**一、研究背景与问题**

塑料污染已成为全球性重大环境挑战，塑料碎片尤其引发对其生态和健康影响的担忧。聚苯乙烯（PS）是使用最广泛、在各类生态系统中最常被检出的塑料污染物之一。新近证据表明，小粒径聚苯乙烯颗粒可通过多种途径进入人体，蓄积于肝脏、肾脏、肺、胎盘、肠道乃至大脑，干扰细胞稳态并损害器官功能。其生物效应受粒径和表面官能化等理化特性强烈影响，但这些特性并非固定不变，在含蛋白介质中分散时可能发生改变。在肾脏中，聚苯乙烯微塑料（PS-MP）暴露通过氧化应激、线粒体功能障碍和炎症信号等多重机制引起肾毒性，可能促进肾损伤和慢性肾脏病。然而，现有策略以减少塑料使用和环境清除为主，在微塑料已蓄积于组织并启动病理过程后缺乏治疗价值。近年来，天然生物活性化合物被日益关注。Panduratin A（PA）和Pinostrobin（PIN）均为从姜科植物指姜（Boesenbergia rotunda L.）根茎中分离的活性黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和细胞保护特性，并被报道可减轻顺铂、镉和庆大霉素诱导的肾毒性。然而，两者能否对抗微塑料诱导的肾损伤尚不清楚。在表面修饰的聚苯乙烯微塑料中，氨基化聚苯乙烯（PS-NH₂）因表面带正电，在既往体外研究中持续表现出比普通PS和羧基化PS（PS-COOH）更强的细胞毒性，因此成为研究微塑料肾损伤及评估干预措施的合适模型。基于PA和PIN的生物活性与PS-MP肾损伤主要通路之间的高度重叠，本研究首次在体外和体内模型中探讨二者对PS-NH₂诱导肾损伤的保护作用。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员以人肾近端小管上皮细胞（HK-2）为体外模型、C57BL/6NJcL小鼠为体内模型，系统评估了PA和PIN对PS-NH₂肾毒性的保护作用及机制。结果表明，PS-NH₂在三种颗粒中细胞摄取最多、细胞毒性最强，并通过增加颗粒内化、诱导氧化应激和凋亡造成肾细胞损伤；PA和PIN预处理可降低PS-NH₂摄取、减少活性氧（ROS）生成并抑制凋亡。体内实验中，每日口服PS-NH₂（0.4 mg/天，28天）虽未改变体重、摄食量及血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平，但引起了早期近端肾小管变性；PA和PIN预处理均减轻了组织病理学损伤，且PIN效果优于PA。这些发现提示氨基化微塑料具有肾毒性风险，天然化合物尤其PIN有望成为缓解微塑料相关肾损伤的候选干预手段。

**三、主要关键技术方法**

研究人员采用动态光散射（DLS）和zeta电位测量表征三种聚苯乙烯颗粒在去离子水和含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基中的水合粒径、多分散指数（PDI）和表面电荷。体外实验中，使用MTT法检测细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放法评估膜完整性、流式细胞术检测颗粒摄取和细胞凋亡、DCFH-DA荧光探针测定胞内ROS水平。体内实验中，24只雄性C57BL/6NJcL小鼠（5周龄，17–20 g，购自Nomura Siam International Co., Ltd.，泰国曼谷）随机分为4组，PS-NH₂以0.4 mg/天经口灌胃28天，PA（25 mg/kg体重）和PIN（40 mg/kg体重）在暴露前1小时每日给药；肾组织经苏木精-伊红（H&E）染色后，依据国际毒理病理学命名与诊断标准（INHAND）进行半定量组织病理学评分。统计采用单因素方差分析和Tukey事后检验。

**四、研究结果**

*4.1 PS-MPs的表征*

在去离子水中，PS-NH₂的zeta电位负值最小（?25.27 mV），而普通PS为?63.43 mV、PS-COOH为?36.45 mV。在含FBS培养基中，三种颗粒的zeta电位均趋近于近中性（PS：?14.50 mV；PS-COOH：?6.22 mV；PS-NH₂：?7.72 mV），且PDI值均升高，其中PS-NH₂的PDI增幅最大（0.584），表明血清蛋白吸附改变了颗粒的胶体性质并增加了尺寸异质性。

*4.2 聚苯乙烯微塑料对HK-2细胞活力、膜完整性和形态的影响*

在50 μg/mL剂量暴露24小时后，PS-NH₂诱导的细胞活力降低最为显著，LDH释放明显增加，而普通PS和PS-COOH无显著变化。PS-NH₂对细胞活力的抑制作用呈浓度依赖性，从12.5 μg/mL起显著下降，在50–200 μg/mL时更为明显。形态学观察显示，PS-NH₂暴露48小时后细胞损伤和形态改变更明显。基于此，后续实验选用50 μg/mL作为PS-NH₂的亚致死毒性剂量。

*4.3 PA和PIN的细胞毒性*

PA浓度≥5 μM时引起HK-2细胞形态改变和细胞毒性，而1.0和2.5 μM浓度无显著影响；PIN在0–100 μM范围内未显示细胞毒性。故后续实验选用PA（2.5 μM）和PIN（50 μM）进行。

*4.4 表面官能化对PS-MPs细胞摄取的影响*

流式细胞术检测显示，PS-NH₂处理后侧向散射（SSC）阳性细胞比例增加，荧光标记的PS-NH₂阳性细胞率为52.50±1.50%，显著高于PS-COOH的29.93±1.6%，提示氨基化修饰促进了颗粒的细胞摄取。

*4.5 PA和PIN抑制PS-NH₂诱导的细胞摄取*

单独暴露时PS-NH₂的内化率为36.7±10.09%；PA预处理后降至19.23±2.61%，PIN预处理后降至22.53±5.09%，表明两种化合物均可显著减少PS-NH₂进入细胞。

*4.6 PA和PIN减弱PS-NH₂诱导的胞内ROS生成*

DCFH-DA染色显示，PS-NH₂暴露显著增强绿色荧光，而PA和PIN共处理均明显降低了荧光强度，证明两者可抑制PS-NH₂诱导的细胞内氧化应激。

*4.7 PS-NH₂对凋亡的影响及PA和PIN的保护作用*

Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术显示，PS-NH₂将晚期凋亡细胞比例从2.05±1.86%增至13.45±0.40%；PA和PIN预处理分别将晚期凋亡比例降至8.10±0.67%和6.11±1.19%，表明二者可部分抑制颗粒诱导的细胞凋亡。

*4.8 PS-NH₂及PA、PIN对小鼠生理参数的影响*

28天实验期间，各组小鼠体重和摄食量无显著差异；肾脏与体重比值大多相近，PIN组略低可能与初始体重差异有关。血清BUN和CRE在各组间均无显著变化，提示该暴露条件下未见明显肾功能损害。

*4.9 PS-NH₂暴露及PA、PIN共处理对肾组织病理学的影响*

组织病理学检查发现，对照组六只动物肾脏均未见明显病变（0/6）；PS-NH₂组六只中五只出现肾皮质近端小管局灶至多灶性、轻微至轻度变性（平均严重度评分从0增至1±0.58）；PA共处理组六只中三只出现类似病变，平均评分为0.67±0.74；PIN共处理组仅六只中一只出现轻微局灶性变性，平均评分0.17±0.37，与对照组相当。结果表明PIN在体内对PS-NH₂诱导的肾脏早期组织损伤具有更显著的保护作用。

**五、讨论与结论总结**

讨论部分指出，肾脏因其高血流量和滤过功能是微纳塑料的潜在靶器官。PS-NH₂在含血清培养基中zeta电位与其他颗粒趋同，因此单纯表面电荷不能解释其更高的毒性；PS-COOH形成的可见聚集体降低了有效细胞接触，而PS-NH₂分散更细、更易被细胞内化。细胞摄取增加与ROS升高和凋亡增强密切相关，氧化应激是颗粒致肾小管细胞损伤的上游机制。PA的肾保护作用与其抑制ERK1/2和caspase-3/7激活、改善线粒体功能及恢复Bcl-2表达有关；PIN则通过其黄烷酮结构直接清除自由基，并抑制NF-κB通路以减少炎症因子产生。PIN在体内效果优于PA可能与其药代动力学特征有关：PA的口服生物利用度约9%、肾脏组织-血浆比仅0.1倍、达峰时间约8小时；而PIN在口服后0.133小时即达峰浓度，吸收更快、起效更早。研究结论为：PS-NH₂通过增强细胞摄取、氧化应激和凋亡在体内外引起肾毒性，并造成早期肾损伤；PA和PIN均具有肾保护作用，其中PIN的体内效果更佳。该研究突显了氨基化微塑料的肾脏风险，并支持天然化合物（尤其是PIN）作为缓解微塑料相关肾损伤的潜在策略，未来需进一步研究其分子机制和长期效应。