《Connective Tissue Research》：Inflammatory crosstalk between rotator cuff tissues is altered with age and sex
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目的：肌肉骨骼疾病，尤其是影响肩部的疾病，是老龄化人群中一个重要的健康问题。然而，关节退变的始动因素仍知之甚少。既往研究主要聚焦于单个肌肉骨骼组织随年龄发生的变化，对组织之间复杂相互作用的研究十分有限。近年来关于肌肉骨骼组织与其他器官之间通讯的研
摘要专业翻译
目的：肌肉骨骼疾病，尤其是影响肩部的疾病，是老龄化人群中一个重要的健康问题。然而，关节退变的始动因素仍知之甚少。既往研究主要聚焦于单个肌肉骨骼组织随年龄发生的变化，对组织之间复杂相互作用的研究十分有限。近年来关于肌肉骨骼组织与其他器官之间通讯的研究受到关注，但肩关节内部的局部相互作用仍未得到充分探索。本研究旨在探讨骨-肌腱-肌肉串扰（crosstalk）中与年龄和性别相关的差异，假设这些相互作用因年龄和性别而异，且老年组织和雌性组织表现出减弱的分泌表型。
方法：研究人员采用新型体外单培养（monoculture）及全组织外植体共培养（co-culture）体系，评估来自年轻和老龄雄性及雌性C57BL/6J小鼠的骨、肌腱和肌肉的炎症反应。
结果：研究结果揭示了细胞因子分泌中存在显著的年龄和性别依赖性差异，老龄雄性和雌性小鼠均表现出改变的炎症谱。研究人员观察到单培养中促炎细胞因子分泌总体增加，而衰老进一步放大了这一反应。组织共培养显示，骨与肌腱之间的串扰主要通过分泌因子介导，而肌肉-肌腱通讯则需要物理邻近或接触，提示这两种组织之间存在不同的相互作用模式。性别差异在单个组织反应和跨组织通讯模式中均很明显。然而，这些性别差异随衰老而减弱，表明与年龄相关的组织特异性信号衰退可能压过了基于性别的差异。
结论：研究结果表明，肌腱在介导组织间通讯中发挥关键作用，而衰老以性别依赖的方式破坏了这种串扰。
论文解读文章
一、研究背景与研究意义
年龄相关的关节退行性病变是日益严峻的社会经济和情感负担，尤其在人口老龄化不断加剧的背景下尤为突出。目前尚无能够改变疾病进程的药物，许多患者最终只能接受人工关节置换手术。尽管关节退变发病率极高，但其始动因素和关键促成机制至今仍不明确。既往研究大量聚焦于单个肌肉骨骼组织随年龄发生的病理变化，而对组织之间复杂相互作用的研究相对匮乏。越来越多的证据表明，某一组织的损伤可加速邻近组织的退变。例如，肩袖撕裂常伴随进行性肌肉萎缩、脂肪浸润以及肱骨头重塑，提示肌腱病变可主动驱动相邻肌肉和骨的变化。此外，肌肉骨骼组织与其他器官系统（如肾脏、脑、肠道）之间的串扰研究正获得越来越多的关注和经费支持，尤其是在运动生理学领域。然而，对于滑膜关节内部组织间的通讯，尽管各组织在空间上极为邻近甚至存在物理连接，相关研究仍然十分有限。肌腱和韧带在力学上充当不同肌肉骨骼组织之间的传导结构，但很少有研究探讨它们在介导关节内串扰中的角色。
历史上，肌腱常被视为被动的力学连接结构，而非关节稳态中的活跃生物学参与者。然而，多个研究团队已证明肌腱通过细胞因子和各种免疫细胞在肌腱病（tendinopathy）的炎症环境中发挥重要作用。肩关节是肌腱病及随后骨重塑和肌肉萎缩的常见部位，主要由肩袖肌腱和肌群维持稳定。尽管如此，关于肌腱与肌肉之间串扰的研究仍然有限。研究人员此前开发了一种新型体外骨-肌腱-肌肉（bone-tendon-muscle, BTM）器官培养系统，可对局部组织相互作用进行可控研究。该研究发现肌腱对肌肉和骨的联合损伤反应迅速，表现出炎症、细胞死亡和基质退变，首次证明肌腱是滑膜环境中的生物学参与者，并能对来自肌肉和骨的双重信号做出响应。然而，由于肌腱的反应是由肌肉和骨同时损伤所触发，具体由哪种组织驱动这些变化尚不清楚，肌肉和骨是否也能响应来自肌腱的信号也尚未明确。
考虑到肌肉骨骼退变速率在性别和年龄上的差异报道，探讨串扰是否依赖于这些生物学因素具有重要意义。多种年龄相关疾病会改变骨和肌肉细胞的分泌表型，提示循环系统中的串扰发生了改变。此外，循环炎症环境随时间推移出现失调，即所谓的“炎症性衰老”（inflammaging）理论。关节内持续升高的促炎细胞因子水平也与骨关节炎（osteoarthritis）、肌腱病、应力性骨折和肌少症（sarcopenia）的进展相关。然而，局部串扰如何随衰老变化及其对关节疾病进展的贡献尚不清楚。在性别方面，大量证据表明男性和女性在关节疾病进展和组织重塑机制上存在差异。此外，基于老年女性中关节疾病的高发病率，年龄与性别之间可能存在显著交互作用。尽管如此，迄今尚无研究关注局部组织间通讯中的性别差异。
因此，本研究的总体目标是明确骨、肌腱和肌肉三种肌肉骨骼组织之间串扰中与年龄和性别相关的差异。研究人员假设老年组织和雌性组织表现出减弱的分泌表型。通过系统评估肌腱与肌肉以及肌腱与骨之间的生化信号，该研究旨在阐明肌肉骨骼退变背后的潜在机制，为理解组织特异性衰老如何影响全关节病理提供关键一步，并为靶向治疗干预的开发奠定基础。
二、主要技术方法
研究人员从年轻（4月龄，约相当于人类20–30岁）和老龄（24月龄，约相当于人类56–69岁）的雄性及雌性C57BL/6J小鼠中获取肩部骨-肌腱-肌肉外植体。老龄小鼠来自NIH/NIA老龄化啮齿动物群体，年轻小鼠来自Jackson Laboratories。研究设置了骨、肌腱、肌肉的单独单培养组，保留天然连接的骨-肌腱共培养组和肌肉-肌腱共培养组，以及屈趾长肌腱（flexor digitorum longus, FDL）作为肌腱组。为研究分泌因子的作用，研究人员收集肌肉和骨单培养24小时后的条件培养基（conditioned medium），与新鲜培养基按1:1混合后施加于肌腱外植体。所有分泌因子添加均进行年龄和性别匹配。培养24小时后，采用定制Meso Scale Diagnostics多斑点检测法量化培养基中IFN-γ、IL-1β、KC/GRO（小鼠IL-8类似物）、MCP-1、TNF-α等促炎细胞因子以及IL-6、IL-4、IL-10、IL-15等抗炎或促再生细胞因子的蛋白水平。数据以相对于单培养对照的倍数变化表示，采用非配对双尾t检验进行统计学比较。
三、研究结果
单培养中的年龄相关分泌差异：在骨单培养中，老龄雄性分泌的IL-10、IL-1β和IL-4高于年轻雄性；老龄雌性分泌的MCP-1减少但TNF-α增多。在肌腱单培养中，老龄雄性分泌的IFN-γ减少而IL-1β增多；老龄雌性分泌的IL-6、KC/GRO和TNF-α增多。在肌肉单培养中，老龄雄性产生的IL-6、KC/GRO和TNF-α增多；老龄雌性除IFN-γ分泌减少外，其余细胞因子与年轻雌性无显著差异。
年轻组织中的性别差异串扰：在响应骨分泌因子时，年轻雌性肌腱总体分泌蛋白较少，IFN-γ、IL-10、IL-15和IL-1β显著低于年轻雄性，但KC/GRO和MCP-1在雌性中升高。在响应肌肉分泌因子时，雌性肌腱的IL-6、KC/GRO、MCP-1和TNF-α产生减少。在骨-肌腱共培养中，年轻雄性的IL-10、IL-15、IL-1β、IL-4、IL-6和MCP-1浓度高于年轻雌性。在肌肉-肌腱共培养中，年轻雌性几乎所有细胞因子（IL-15、IL-1β、IL-4、IL-6、KC/GRO、MCP-1和TNF-α）的分泌均减少。
老龄组织中的性别差异串扰：在响应骨分泌因子时，老龄雌性肌腱分泌的促炎细胞因子MCP-1和TNF-α显著高于老龄雄性，而IL-4分泌减少。骨-肌腱共培养对大多数骨分泌分析物影响甚微，仅老龄雌性TNF-α分泌增加。在肌肉分泌因子存在下，老龄雌性肌腱的IL-10和KC/GRO分泌增加，抗炎细胞因子IL-15和IL-4分泌减少。肌腱与肌肉共培养对肌肉分泌影响甚微，仅老龄雌性IL-4分泌显著降低。
雄性组织中的年龄效应：在响应骨分泌因子时，老龄雄性肌腱分泌的IFN-γ、IL-10、IL-6和TNF-α减少。在响应肌肉分泌因子时，唯一的变化是IL-10产生增加。在骨-肌腱共培养中，老龄雄性组织中促炎（IL-6、IL-1β、MCP-1）和抗炎（IL-4、IL-10、IL-15）串扰均显著低于年轻雄性。在肌肉-肌腱共培养中，IL-6、IL-15和MCP-1的串扰显著降低。
雌性组织中的年龄效应：在响应骨分泌因子时，老龄雌性肌腱的IFN-γ和IL-15产生增加，而KC/GRO和MCP-1分泌减少。在响应肌肉来源因子时，IL-10、IL-6、KC/GRO、MCP-1和TNF-α分泌增加，而IL-4和IL-15串扰减少。在含雌性骨和肌腱的共培养中，IFN-γ、IL-10、IL-15、KC/GRO和MCP-1产生随衰老增加。在肌肉-肌腱共培养中，仅MCP-1产生随衰老增加，其余细胞因子保持不变。
四、讨论与结论
本研究发现，无论性别如何，应力剥夺条件下单培养的组织确实分泌多种炎症细胞因子，其中IL-6、KC/GRO和MCP-1的浓度与肌腱病和关节炎患者滑液中测得的水平相当（ng/mL级别），这可能与取材过程中的锐性分离有关。骨和肌肉培养中的细胞因子水平平均比肌腱培养高约九倍，这与组织大小差异相符。总体上，促炎细胞因子分泌随衰老而放大，符合“炎症性衰老”的概念。值得注意的是，老龄雄性骨单培养中IL-10和IL-4也升高，这可能是对衰老相关促炎环境的代偿性抗炎反应。雌性肌肉单培养几乎未表现出年龄相关的炎症分泌差异，这可能与小鼠在整个衰老过程中雌激素水平相对稳定有关，与绝经后人类雌激素急剧下降不同。
在串扰方面，年轻雄性组织中额外组织的加入几乎总是放大炎症反应，有时高达10倍以上，且不能简单归因于两个单培养细胞因子产量的加和，考虑到肌腱体积和细胞密度较小，这提示肌腱在肌肉和骨产生的细胞因子水平中发挥主动信号作用。然而，这一现象在年轻雌性或老龄共培养组中并不成立。年轻小鼠来源的组织中可清晰识别出性别差异，几乎所有细胞因子在年轻雌性中均低于年轻雄性（KC/GRO和MCP-1除外），这与通常认为雌性免疫反应更强的观点相反，可能与本研究中缺乏激素有关。衰老显著扰乱了组织信号传导，但取决于性别和串扰方向/起始因子：雌性组织间通讯大多随年龄增加，而雄性则随年龄减少。骨-肌腱串扰受衰老影响大于肌肉-肌腱相互作用，这可能与滑膜腔内骨-肌腱直接相互作用以分泌蛋白为主导机制有关。肌肉-肌腱通讯中IL-15和IL-6的显著下降值得关注，这两种细胞因子均为已知的运动和损伤诱导的肌因子（myokine），提示物理连接可能是肌肉与肌腱串扰的关键。
研究结论指出，肌腱在介导组织间通讯中发挥关键作用，衰老以性别依赖的方式破坏这种串扰。组织间串扰的高度年龄和性别依赖性提示，肌腱功能障碍可能加剧衰老相关的肌肉骨骼退变，肌腱是年龄相关关节病理中一个关键但常被忽视的参与者。该研究为理解组织特异性衰老如何影响全关节病理提供了重要基础，对未来开发性别特异性和年龄特异性的靶向治疗干预具有指导意义。
