RNF43 p.G659fs经PI3K/AKT/mTOR信号与HLA-E上调导致MSI-H结直肠癌自然杀伤细胞功能障碍

《SCIENCE ADVANCES》：RNF43 p.G659fs leads to natural killer cell dysfunction in MSI-high colorectal cancer through PI3K/AKT/mTOR signaling and HLA-E up-regulation

　　

RNF43 p.G659fs（RNF43659mut）突变发生于8%的结直肠癌（colorectal cancer, CRC）中，并在微卫星高度不稳定（microsatellite instability–high, MSI-H）肿瘤中富集。尽管RNF43659mut可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素机制性靶标（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mechanistic target of rapamycin, PI3K/AKT/mTOR）激活促进肿瘤生长且独立于WNT信号，其免疫学效应尚不清楚。研究人员显示，RNF43659mut在MSI-H CRC中塑造抑制性自然杀伤（natural killer, NK）细胞景观。单细包RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）与多重免疫组化揭示RNF43659mut肿瘤中NK细胞浸润增加，但这些细胞呈抑制表型。批量RNA测序与NK细胞和RNF43659mut等基因系及MSI-H患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）共培养显示功能性NK亚群减少、活化标志物下降、抑制受体增加及细胞毒能力受损。机制上，RNF43659mut介导的PI3K/AKT激活诱导HLA-E表达，抑制NK功能；药理或小干扰RNA抑制PI3K/AKT可恢复NK活性并增强杀伤。空间分析显示NKG2A+ NK细胞与HLA-E+肿瘤细胞邻近，且毗邻PI3K/AKT活化肿瘤细胞，揭示局部免疫抑制生态位。这些发现阐明MSI-H CRC中PI3K/AKT-HLA-E/NKG2A轴作为克服免疫治疗耐药的潜力靶点。

研究背景：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症死亡主要原因之一，MSI-H（microsatellite instability–high，微卫星高度不稳定）肿瘤因错配修复缺陷产生大量新抗原，对免疫治疗较敏感，但并非所有患者均获益，说明存在未知免疫逃逸机制。RNF43（Ring Finger Protein 43，E3泛素连接酶）突变见于约15%至20% CRC，其中C端RNF43 p.G659fs（RNF43^659mut）约占全部CRC的8%，在MSI-H中达22%至42%。该突变不依赖WNT，而通过PI3K/AKT/mTOR（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mechanistic target of rapamycin，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素机制性靶标）促生长，但其对免疫微环境尤其NK（natural killer，自然杀伤）细胞的影响未明。研究人员由此开展该项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究，旨在无偏解析RNF43^659mut MSI-H CRC的免疫景观并明确NK失调机制。

主要关键技术方法：研究人员使用三个临床样本队列，Cohort-1为33例未治疗原发MSI-H CRC的scRNA-seq，Cohort-2为91例MSI-H CRC多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF），Cohort-3为14例MSI-H CRC环状免疫荧光（cyclic immunofluorescence, CyCIF）；辅以CRISPR编辑等基因HT29、LS513细胞与RNF43^659mut过表达HCT116细胞、患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）及健康供体NK共培养、分选NK批量RNA测序、小干扰RNA与perifosine药理抑制、抗NKG2A抗体monalizumab组合、CRISPR敲除HLA-E及空间最近邻分析。

研究结果：

Differential immune profiles in RNF43^659mut versus RNF43^wt MSI-H CRC tumors：通过Cohort-1 scRNA-seq与Cohort-2 mIF，研究人员发现RNF43^659mut肿瘤中NK细胞与ZBTB16⁺ T细胞富集，NK密度在上皮内及总体区域升高，而B细胞、髓系等其他免疫亚群无差异；突变肿瘤细胞TMB更高、B2M更低但经典HLA-I基本不变，提示NK浸润非单纯“丢失自我”驱动。

Increased expression of NK cell inhibitory receptors and decrease in activation markers in RNF43^659mut-NK cell cocultures：HT29等基因系与PDO和NK共培养显示，RNF43^659mut条件下CD56^dim/bright、CD16、NKG2D下调，NKG2A、TIM-3、KIR3DL1上调；分选NK的RNA-seq见活化/细胞毒基因NCR3、TNFRSF9下降，抑制/耗竭基因HAVCR2、KLRC1、CD274上升，证明肿瘤细胞内在突变致NK功能抑制而非数量减少。

RNF43^659mut impairs NK cell cytotoxicity in CRC：在HT29、LS513、HCT116^OE及PDO中，RNF43^659mut使NK介导杀伤显著下降，且呈等位基因剂量依赖；CRISPR将杂合PDO转为纯合突变后抗性增强，mCherry类器官活细胞成像见mut/mut类器官存活而wt/mut被清除，说明该突变赋予CRC广谱NK杀伤抵抗。

PI3K/AKT/mTOR pathway activation with RNF43^659mut leads to NK cell immune evasion via HLA-E up-regulation：多模型显示RNF43^659mut伴PI3K/AKT/mTOR活动增强，HOX/SOX2/CD109及FOXO1/FOXO3/EIF4EBP1/RICTOR上调，并见PD-L1、LGALS9、ISGs及HLA-E明显上调；免疫印迹确认HLA-E在细胞系与类器官中随pAKT升高而升高，表明PI3K/AKT驱动HLA-E是非经典MHC-I介导NK逃逸核心。

PI3K/AKT pathway inhibition restores NK cell function by modulating HLA-E expression：siRNA敲低AKT1/PIK3C2A或perifosine抑制PI3K/AKT，降低HLA-E、恢复NK杀伤与NKG2D/IFN-γ/TNFα表达；perifosine联合monalizumab较单药更强。HLA-E敲除部分恢复杀伤但弱于通路抑制，说明PI3K/AKT还调控其他抑制机制；trogocytosis仅短暂低水平获得HLA-E，非主要驱动。

Spatial analysis of RNF43^659mut tumors reveals PI3K/AKT-linked immune checkpoint evasion via HLA-E/NKG2A：CyCIF显示突变瘤内pAKT⁺与HLA-E⁺肿瘤区共存，NKG2A⁺ NK细胞在20 μm内更易邻接HLA-E⁺细胞，pAKT⁺与HLA-E⁺上皮空间耦合评分由0.18升至0.47，NKG2A⁺NK-HLA-E⁺肿瘤评分由0.31升至0.69，证实局部pAKT高、HLA-E富、NKG2A⁺ NK浸润的抑制生态位。

讨论总结：研究人员指出，RNF43^659mut在MSI-H CRC中既促肿瘤又通过PI3K/AKT-HLA-E/NKG2A抑NK；ZBTB16⁺先天样淋巴细胞富集提示更广 innate-like 重塑。过表达模型仅作机制补充，健康供体IL-2/IL-15刺激NK虽不等同瘤内NK，但跨供体表型一致。HLA-E敲除证明其为功能介质而非仅相关；PI3K/AKT还可调PD-L1、经典MHC-I，与HLA-E共同逃避免疫。perifosine或siRNA降HLA-E、复NK活、增杀伤，联用monalizumab增效，为RNF43^659mut及PI3K活化肿瘤提供“通路抑制＋NK checkpoint阻断”组合依据。

结论翻译：该研究阐明RNF43 p.G659fs（RNF43^659mut）突变如何于MSI-H CRC中致NK细胞功能障碍与免疫逃逸。scRNA-seq与mIF示突变瘤NK浸润增但功能抑；共培养示成熟与细胞毒受损；机制为PI3K/AKT/mTOR激活上调HLA-E，药理/遗传抑PI3K/AKT可恢复NK杀伤；CyCIF空间分析证pAKT高、HLA-E富肿瘤区偏好募集NKG2A⁺ NK，形成HLA-E/NKG2A检查点抑制。研究将PI3K/AKT/mTOR定为RNF43^659mut MSI-H CRC可行靶点，降HLA-E、复NK功能可增免疫疗效，支持PI3K/AKT/mTOR抑制剂联免疫检查点及NK导向疗法，以克服该类与PI3K通路突变肿瘤的免疫耐药。