《SCIENCE ADVANCES》：Computational design of optimized and preferentially paired human TCR constant regions for improved T cell function
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T细胞受体（T cell receptor, TCR）基因转移是一种有前景的癌症免疫治疗方法，但其疗效受到TCR链错配的限制，错配会降低表面表达并可能产生脱靶特异性。研究人员应用PROSS和FuncLib算法对人类TCR恒定区进行工程改造，以提高稳定性和优先配
T细胞受体（T cell receptor, TCR）基因转移是一种有前景的癌症免疫治疗方法，但其疗效受到TCR链错配的限制，错配会降低表面表达并可能产生脱靶特异性。研究人员应用PROSS和FuncLib算法对人类TCR恒定区进行工程改造，以提高稳定性和优先配对。经过数轮筛选，研究人员鉴定出一个变体，命名为结构增强TCR（structurally enhanced TCR, SET），该变体表现出显著增强的表面表达、功能性亲合力（functional avidity）以及减少的错配。表达SET的T细胞分泌更高水平的细胞因子，展现出增强的活化，并介导了优越的细胞毒性。值得注意的是，SET在CD4+ T细胞中表现出功能，并在异种移植模型中介导了强效的肿瘤控制，显著延缓了肿瘤生长并提高了生存率。SET的益处在六个不同的TCR中均可重现，支持其广泛的适用性。这些发现突显了合理设计在提高TCR疗法效力方面的潜力。
T细胞是适应性免疫系统的核心组分，其通过T细胞受体（T cell receptor, TCR）识别主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）呈递的抗原。TCR复合体由八个亚基组成，其中α和β链的恒定区负责二聚化以及与CD3信号复合体的相互作用。然而，TCR链的固有稳定性不足，特别是TCRα链，导致受体生物发生效率低下。TCR基因转移是一种前景广阔的癌症免疫治疗策略，但工程化TCR链与内源链之间的错配会降低表面表达并可能产生脱靶特异性。既往的工程策略，如恒定区鼠源化、引入额外二硫键等，虽然取得进展，但仍存在部分错配或引入大量非天然氨基酸的问题。因此，需要一种能普遍提高TCR表达和优先配对的方法。
为此，研究人员采用计算蛋白设计策略，对TCR恒定区进行优化。首先应用PROSS算法设计提高表面稳定性的突变，再利用FuncLib算法优化α/β界面，经过三轮筛选获得最优设计SET，包含18个突变。SET在多个维度上改善了T细胞功能。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。
研究人员从以色列血库获得健康供体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），并使用了多种细胞系。主要技术方法包括：基于PROSS和FuncLib算法的计算设计；体外转录mRNA电穿孔转染原代人T细胞表达TCR；逆转录病毒（pMSGV1载体）转导T细胞；流式细胞术检测TCR表达、配对和激活标志物；酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测细胞因子分泌；功能亲合力测定采用TAP缺陷T2细胞负载不同浓度抗原肽；细胞毒性实验利用IncuCyte系统；体内实验使用NSG小鼠异种移植模型。
**设计提高TCR的表面表达和优先配对**
通过共培养细胞因子释放的功能筛选，研究人员发现PROSS设计的stab1与FuncLib设计的top1结合后，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNFα）分泌比亲本TCR提高约3倍。继续优化得到D14，TNFα分泌提高3.5倍。在此基础上加入LVL基序得到SET。通过流式细胞术检测MART-1/HLA-A*0201四聚体染色和Vβ12抗体染色，SET表现出最高的表面表达，且错配组合α5LVL/WTβ无检测到信号，β3/WTα信号低于设计配对，表明SET具有部分正交配对特性。功能亲合力实验显示SET的半数有效浓度（EC50）为4.1×10
?8 M，低于野生型（wild-type, WT）的1.5×10
?7 M，且对MART-1阴性细胞无反应，表明特异性保留。
**SET表现出改善的正交性并提升T细胞活性**
在竞争实验中，添加WT竞争TCR后，WT DMF4的表达降至四分之一，而SET和D14基本保持不变，表明设计链受内源链干扰小。个体突变分析揭示了多个突变（如Ser60Glnα和Ser77Thrβ）的贡献，且发现Leu63Tyr需要与其他突变协同才有效。
**SET在受控细胞环境中表现出优先链配对**
使用TCR缺失的Jurkat RT3-T3.5细胞，研究人员验证了SET链的优先配对，并进一步确认在存在竞争TCR的条件下，SET表达水平不降低，而WT DMF4表达显著下降。
**链间特异性的结构基础**
结构分析表明Ser60Glnα替代了α/β界面中一个保守水分子并形成氢键网络，Ser77Thrβ增加界面堆积并预组织氢键。这些突变在天然TCR中不存在，且Ser60Gln需要两个核苷酸置换，难以通过常规突变筛选发现。
**SET TCR在原代人T细胞中表现出增强的抗肿瘤活性**
通过逆转录病毒转导，SET表达导致特异性四聚体染色阳性率从22.9%增加至58.6%。与肿瘤细胞共培养后，SET组的白细胞介素-2（interleukin-2, IL-2）、TNFα和干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）分泌量比WT增加4至13倍，激活标志物CD69、CD25、CD137的上调也显著增强。
**SET在CD4
+ T细胞中展示改善的功能**
分选出CD4
+ T细胞后，表达SET的细胞在与肿瘤靶细胞共培养时TNFα、IFN-γ和IL-2分泌显著增加，说明SET可在无CD8共受体支持下发挥功能。
**SET在不同抗原特异性中广泛增强TCR功能**
将SET恒定区嫁接到分别针对gp100、NY-ESO-1、EBV-LMP2、SARS-CoV-2刺突蛋白的四个TCR上，均观察到细胞因子分泌水平增加，表明SET具有通用性。
**表达SET设计的T细胞表现出增强的细胞毒性和体内活性**
细胞毒性实验显示SET-T细胞在48小时后使靶细胞活力降至约30%，优于D14（约47%）和WT（约78%）。在NSG小鼠异种移植模型中，SET-T细胞显著延缓肿瘤生长并提高生存率：第83天SET组平均肿瘤体积比D14或WT组小35%，第127天SET组生存率为100%，而NGFR、D14和WT组均低于50%。
在讨论部分，研究人员指出SET的突变组合具有上位性效应，说明传统单突变筛选难以发现此类优化方案。SET仅引入18个突变，相比鼠源化恒定区的90个突变，预测的新抗原肽（neoepitope）负担更少，但免疫原性仍需实验评估。基因组编辑与SET互补，可结合使用以进一步减少错配。SET未改变可变区，因此不会改变肽-MHC（peptide-MHC, pMHC）特异性，但增加表达可能降低激活阈值。未来需进行更广泛的交叉反应性筛查。此外，SET也适用于病毒抗原，显示其通用性。
研究结论翻译：总而言之，该研究展示了计算设计应用于TCR恒定区可以改善T细胞功能的多个关键方面，为基于TCR基因转移的免疫疗法提供了更合理的设计基础。
