《International Journal of Molecular Sciences》：Establishment of a Three-Dimensional In Vitro Model of Taste Bud Cells for Fat Taste Investigation
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脂肪味觉正逐渐被视为第六种基本味觉模态，其中CD36已被鉴定为口腔感知长链脂肪酸的关键受体。味觉物质与味蕾细胞（TBCs）上的受体结合，触发细胞内钙离子动员、神经递质释放、激活味觉传入神经纤维，并将感觉信息传递至大脑。传统的二维（2D）培养体系无法重现体内至关
脂肪味觉正逐渐被视为第六种基本味觉模态，其中CD36已被鉴定为口腔感知长链脂肪酸的关键受体。味觉物质与味蕾细胞（TBCs）上的受体结合，触发细胞内钙离子动员、神经递质释放、激活味觉传入神经纤维，并将感觉信息传递至大脑。传统的二维（2D）培养体系无法重现体内至关重要的复杂三维（3D）结构及细胞间相互作用。本研究开发了一种小鼠味蕾细胞的3D模型，以探究脂肪味觉感知背后的细胞机制。研究人员将永生化CD36阳性味蕾细胞与轮廓乳头来源的味蕾细胞在2D和3D条件下共培养。在3D条件下，味蕾细胞自组装形成球体，展现出细胞器、细胞间连接以及三种主要味蕾细胞类型标志物的表达。与2D培养细胞相比，球体表现出更高的味觉受体表达水平，包括CD36、甜味受体T1R2、鲜味受体T1R1。调控分化的Wnt/β-catenin及Sonic Hedgehog信号通路亦出现上调。球体对亚油酸表现出增强的反应，具有更显著的细胞内钙动员和血清素释放。该模型更忠实地重现了天然味觉组织的结构和功能特性，为研究脂肪味觉机制及潜在调节味蕾细胞功能的因子提供了一个生理相关的体外平台。
论文解读
一、研究背景与科学问题
味觉作为生物体赖以生存的关键感觉模态，在促进能量密集营养物质的摄入和规避潜在有害物质方面发挥着不可替代的作用。目前，甜、咸、苦、酸、鲜五种基本味觉模态已被确立，而脂肪味觉（oleogustus）在过去二十年间逐渐被认定为第六种潜在的基本味觉模态。舌乳头是味觉感知的主要部位，哺乳动物舌乳头分为菌状乳头、叶状乳头和轮廓乳头三类，每个味蕾由约50至100个味蕾细胞（TBCs）组成，包含四种主要细胞类型：具有胶质样支持功能并参与盐检测的I型细胞、负责检测甜味、苦味、鲜味和脂肪味物质的II型受体细胞、与味觉神经元形成常规突触并释放去甲肾上腺素和血清素等神经递质的III型突触前细胞，以及作为其他三种细胞祖细胞的IV型细胞。
在长链脂肪酸（LCFAs）的检测中，多种味觉受体已被鉴定，包括GPR40（FFAR1）、GPR120（FFAR4）和CD36。越来越多的证据表明，CD36是参与LCFAs检测的主要脂肪味觉受体，而GPR120在食物摄入的餐后调节中发挥不同作用，其对LCFAs的亲和力低于CD36。CD36表达的改变可调节摄食行为并促进肥胖的发生发展。在啮齿动物模型中，高脂饮食导致味蕾中CD36表达下调，伴随对膳食脂质敏感性的降低。在人类中，肥胖与CD36表达降低相关，并与口腔脂肪检测能力受损相关联。CD36基因多态性（尤其是rs1761667）及表观遗传修饰（如CpG甲基化）已被证实与肥胖和脂质味觉敏感性降低相关。
然而，传统的二维（2D）培养体系无法重现天然组织中由多种相互作用细胞类型构成的复杂细胞间通讯。在味蕾内部，II型细胞响应味觉物质（甜、苦、鲜）而升高细胞内Ca2?并释放ATP，ATP不仅激活传入神经纤维，还刺激邻近的III型突触前细胞，构成关键的旁分泌信号通路；I型细胞表达的NTPDase2迅速降解ATP以严格调控其胞外可用性；III型细胞释放血清素（5-HT），通过5-HT?A受体对II型细胞施加负反馈调节。这种多维度的通讯网络在2D培养体系中基本缺失，凸显了传统培养模式在模拟味觉生理学方面的局限性。
三维（3D）培养体系已成为模拟组织组织和细胞相互作用的替代方法。虽然基于Lgr5?和Lgr6?祖细胞的类器官方法已能生成包含增殖和分化味觉细胞的多细胞味觉结构，但传统味觉类器官常在Matrigel等细胞外基质中生成，可能引入变异性并限制味觉受体细胞对外部味觉物质的直接可及性。球体（spheroids）代表了一种互补的无支架3D培养方法，已建立的细胞在非粘附条件下自发聚集，相比传统2D培养可促进增强的细胞间相互作用和组织样组织，同时具有相对简单性和可重复性。然而，专门用于研究脂肪味觉的等效小鼠无支架味觉球体模型尚未建立。因此，本研究旨在建立基于永生化CD36?小鼠味蕾细胞和轮廓乳头来源细胞的无支架3D球体模型，在结构、分子和功能水平上表征所得球体，并与传统2D培养进行比较，特别关注脂质感知和对亚油酸的反应。
二、主要技术方法
研究人员使用了两种细胞系：从C57Bl/6小鼠舌乳头上皮经酶解消化分离、通过小鼠端粒酶逆转录酶（mTERT）逆转录病毒转染永生化、并利用磁激活细胞分选（MACS）纯化的CD36阳性味蕾细胞，以及全轮廓乳头来源的味蕾细胞。两种细胞以1：1比例混合，共5000个细胞接种于96孔板，在超低粘附板中经离心诱导形成球体（3D培养），在标准板中维持单层培养（2D培养）。研究采用了冷冻扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）进行超微结构表征，苏木精-伊红（H&E）染色和免疫荧光染色进行组织学及细胞类型鉴定，定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）进行基因表达分析，Fluo-4钙敏感染料进行细胞内钙信号成像，以及酶联免疫吸附测定（ELISA）进行血清素分泌定量。
三、研究结果
3D培养细胞形成具有大量细胞间连接和分泌囊泡的球体。 冷冻扫描电子显微镜显示球体为致密的球形结构，平均直径约220至250 μm，外层细胞大小和形态异质，相邻细胞间存在大量细胞间连接，细胞表面不规则且有纹理。透射电子显微镜进一步揭示球体含有丰富的线粒体、大量细胞内和细胞外分泌囊泡（平均直径约70 nm，范围55.8至81.7 nm）、发育良好的内质网以及桥粒连接，证实球体构成高度组织的多细胞系统，展现活跃的代谢、分泌和细胞间通讯过程。
3D培养细胞表达三种主要类型的味蕾细胞。 H&E染色显示致密的球形结构。免疫荧光染色检测到GLAST（I型细胞标志物）、α-gustducin（II型细胞标志物）、SNAP-25（III型细胞标志物）和CD36的表达。GLAST免疫反应性遍布球体周边和中心区域，而α-gustducin阳性细胞和SNAP-25阳性细胞主要分布于球体外层，CD36在周边和内部区域均有检测，并与部分α-gustducin阳性细胞共定位。QuPath定量分析显示49.43%的细胞为GLAST阳性，41.63%为α-gustducin阳性（其中32.64%为α-gustducin?/CD36?），5.48%为SNAP-25阳性，与天然味蕾中三种主要味蕾细胞群的相对比例一致。
3D培养条件增强味觉受体、Wnt和Shh信号级联的mRNA表达。 qRT-PCR分析显示，与2D培养相比，3D培养细胞中CD36和GPR120（长链脂肪酸受体）、T1R1（鲜味受体亚基）、T1R2（甜味受体亚基）和T2R38（苦味受体）的表达均显著升高，其中CD36上调最为显著（约60倍），T1R1次之（约11倍）。增殖标志物Ki67在3D培养细胞中表达降低约50%。Wnt信号通路组分β-catenin和Lgr5分别上调约2倍和15倍，Shh信号通路相关基因Gli1和Sox2分别上调约3倍和25倍，表明3D培养条件促进更分化的味觉细胞表型。
3D培养条件增强味蕾细胞对不同味觉物质的钙信号反应。 使用Fluo-4钙敏感染料监测细胞内钙动员，25 μM亚油酸刺激下，3D来源细胞的荧光强度增加约40%，显著高于2D培养细胞的约25%；75 μM谷氨酸钠（MSG）刺激下，3D来源细胞荧光增加约20%，2D细胞约11%，但仅亚油酸刺激的差异具有统计学显著性。这一功能观察与CD36、GPR120和T1R1转录水平的升高一致。
3D培养条件增强亚油酸诱导的血清素分泌。 参与血清素合成和囊泡运输的AADC和VMAT-2基因在3D培养细胞中分别上调约4倍和2倍。ELISA定量显示，基础条件下2D和3D培养细胞血清素分泌相似（分别为0.022和0.018 pg/μg蛋白），但100 μM亚油酸刺激后，3D来源细胞分泌显著高于2D细胞（分别为0.15和0.09 pg/μg蛋白），对应基础水平的8倍和4倍增加。
四、讨论与结论
本研究所建立的无支架球体模型为味蕾细胞生物学研究提供了可重复且生理相关的3D体系。球体直径保持在500 μm阈值以下，避免了缺氧或坏死核心的形成，超微结构特征（丰富的线粒体、内质网、分泌囊泡和细胞间接触）与天然味蕾的报道一致。II型和III型细胞主要定位于球体外周，使其易于接受刺激和功能分析，这一无支架构型无需Matrigel包埋或极性逆转程序，简化了培养流程。3D培养条件下味觉受体基因表达的上调、Ki67的降低以及Wnt和Shh信号通路的激活，表明三维微环境通过增强细胞间通讯促进了分化相关信号网络的激活。球体在培养中可维持至少14天的活力和结构完整性，为细胞功能成熟提供了延长时间窗口。研究还指出，尽管该模型重现了味蕾生物学的多个关键特征，但仍是对天然味觉环境的简化表征，未来可纳入味觉神经元和口腔微生物群以进一步提高生理相关性。综上所述，该模型通过结合永生化CD36?味蕾细胞与全轮廓乳头来源细胞，生成了富集脂质感知细胞的多细胞球体，CD36表达的显著上调以及对亚油酸增强的钙和血清素反应支持了该模型在研究脂肪味觉细胞和分子机制中的适用性，同时减少了对动物实验的依赖。
