《International Journal of Molecular Sciences》：Combined Bioinformatic Analysis and RNA Sequencing Uncover Key Tinnitus-Related Molecules in the Cingulate Gyrus
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耳鸣源于适应不良的可塑性和异常的突触功能，不仅涉及听觉通路，也涉及边缘系统区域。其中，扣带回在塑造耳鸣患者常见的情感负担和感觉过滤障碍方面起关键作用。然而，该区域内发挥作用的具体分子机制仍知之甚少，且大多数现有生物信息学预测尚未在活体系统中得到验证。在此，研究
耳鸣源于适应不良的可塑性和异常的突触功能，不仅涉及听觉通路，也涉及边缘系统区域。其中，扣带回在塑造耳鸣患者常见的情感负担和感觉过滤障碍方面起关键作用。然而，该区域内发挥作用的具体分子机制仍知之甚少，且大多数现有生物信息学预测尚未在活体系统中得到验证。在此，研究人员将多数据库挖掘与体内转录组分析相结合，以识别并验证与扣带回耳鸣相关的关键蛋白和通路。研究人员构建并比较了代表听觉感知、声刺激和耳鸣状态的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，从而确定候选枢纽分子。为验证这些候选分子，研究人员使用噪声诱导的小鼠耳鸣模型，通过声惊吓的前脉冲抑制（gap prepulse inhibition of acoustic startle, GPIAS）确认表型，然后对扣带回组织进行RNA测序（RNA-seq）和定量PCR（qPCR）。生物信息学筛选指出AKT1和TNF是核心枢纽，提示存在一个炎症-存活信号轴。在动物实验中，RNA-seq显示耳鸣组Akt1转录本水平明显升高，功能富集分析指出细胞外基质组织、细胞粘附和细胞因子受体通路发生显著变化。qPCR进一步证实了Akt1的上调。综上，研究人员的整合策略确立了AKT1和TNF作为扣带回耳鸣网络中拓扑中心枢纽蛋白的地位，并在体内验证了Akt1上调，为未来研究提供了潜在的生物标志物候选分子和治疗线索。
耳鸣是一种在缺乏相应外部声刺激时对声音的有意识感知，成人患病率约为10%–30%，其临床影响高度异质，部分患者表现为严重的情感困扰和功能障碍。近年研究认为，耳鸣不仅源于听觉通路损伤后的中枢增益放大，还与边缘系统、尤其是扣带回（cingulate gyrus, CG）的适应不良可塑性密切相关。扣带回作为皮质-边缘环路的核心节点，参与听觉信息和情感处理的整合，其功能异常与耳鸣相关苦恼、睡眠障碍及感觉过滤失调有关。然而，该区域内驱动耳鸣病理过程的具体分子机制仍未阐明。此前大多数生物信息学研究仅依赖单一数据源，集中于听觉皮层或下丘等经典听觉结构，且缺乏体内实验验证。为克服上述局限，研究人员设计了“多数据库筛选–体内转录组验证”的两阶段策略，旨在识别并验证扣带回中耳鸣相关的关键蛋白和通路。
研究人员从GeneCards数据库分别提取代表听觉感知（auditory perception, AP）、声刺激（acoustic stimulation, AS）和耳鸣（tinnitus, Tin）的三组基因列表，利用DAVID进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，通过STRING构建三组基因对应的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并采用Cytoscape NetworkAnalyzer比较网络拓扑参数，从而筛选候选枢纽分子。在实验验证阶段，研究人员选用噪声诱导的耳鸣小鼠模型（6周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自武汉鼠来宝生物技术有限公司，饲养于华中科技大学实验动物中心），以100 dB SPL宽带噪声暴露2小时建立模型；通过GPIAS行为检测确认耳鸣样表型后在噪声后第1天采集扣带回组织，分别进行RNA-seq（每组4个生物学重复）和qPCR（每组6个生物学重复）检测。该整合策略最终确立了AKT1和TNF的核心枢纽地位，并在体内证实Akt1上调，为耳鸣分子机制提供了新见解和潜在干预靶点。
### 2.1 听觉感知、声刺激与耳鸣的基因列表
三组基因列表分别包含AP 82个、AS 54个和Tin 104个基因，Venn图显示共有156个独特元素。Tin组特有的48个基因中包括AKT1、TNF、BCL2以及多个细胞外基质（extracellular matrix, ECM）调节转录本（如FLNB、PTK2、CFAP410），初步提示炎症-存活信号和ECM重塑可能参与耳鸣的病理过程。
### 2.2 GO富集分析
GO富集结果显示，AP和AS组的富集主要集中于突触、谷氨酸能突触、轴突、树突等基础神经结构和神经传递相关生物学过程；Tin组则显著富集于“ERK1/2级联的正向调控”“基因表达调控”“动作电位的正向调控”和“DNA损伤应答的内在凋亡信号通路”等条目，提示耳鸣状态下扣带回神经元更倾向于发生胞内信号转导异常、转录调控改变、兴奋性增强和凋亡相关稳态失衡。
### 2.3 AP、AS和Tin过程的PPI网络
通过比较三个PPI网络的节点数、边数、平均邻居数、网络异质性和中心化程度，可见网络复杂性从AP到AS再到Tin逐步增加，即耳鸣网络远比正常听觉感知网络更复杂、更集中。基于节点度和综合得分（combined score, CS）的频率分布分析，AP网络以CHAT和TARDBP为核心，AS网络以SLC6A3和DRD1为核心，Tin网络则以TNF（degree=22）和AKT1（degree=21）为两个最高度枢纽蛋白，预示其构成炎症-存活信号轴。
### 2.4 AP、AS和Tin列表中PPI网络的关键蛋白
以CS第90百分位数作为高得分相互作用蛋白的筛选阈值（AP>0.934，AS>0.862，Tin>0.891）后，AKT1与HSP90AA1和BCL2形成高置信度相互作用；TNF虽为最高度节点，但其相互作用未达该严格阈值，代表性伙伴为GAPDH和BCL2。GO富集表明，Tin组关键蛋白主要参与抗凋亡信号通路的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、葡萄糖代谢过程以及凋亡调控等，提示扣带回在耳鸣状态下出现抗凋亡、应激适应和代谢调节方面的功能重塑。
### 2.5 耳鸣小鼠扣带回中AKT1轴及细胞外基质重塑的转录组验证
GPIAS检测显示，噪声暴露后第1天和第7天出现显著GPIAS下降，第14天恢复至基线水平，第1天用于组织取材。RNA-seq分析共鉴定出116个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中21个上调、95个下调；耳鸣组Akt1转录水平显著升高，同时多个ECM相关基因表达发生显著改变。后续GO富集显示所有DEGs显著富集于ECM组织、细胞粘附和细胞因子受体活性等通路；KEGG分类表明相关基因主要集中于信号转导、免疫系统和细胞交互通路。qPCR进一步验证了Akt1 mRNA在耳鸣组的显著上调。
在讨论中，研究人员指出AP、AS和Tin网络分别对应不同的分子模块：AP网络的CHAT/TARDBP维持胆碱能传递和基础神经元稳态；AS网络的SLC6A3/DRD1介导多巴胺能应激可塑性；而Tin网络以AKT1-TNF炎症-存活模块为主，并伴随ECM重塑。PPI拓扑的渐进重构从分子层面支持中枢增益增强和边缘-听觉网络过度连接。体内转录组证实了Akt1上调，但Tnf未达到显著差异，且AKT1与TNF的直接相互作用未在本研究中实验验证；ECM相关通路改变源自全转录组DEG富集，尚不能确定其与AKT1的因果关系。这些结果共同支持扣带回作为联系耳鸣感知与负性情绪的枢纽区域，也提示炎症-存活信号和ECM环境失衡可能是耳鸣情感共病的重要分子基础。
研究结论可概括为：扣带回中的PPI网络和关键蛋白在听觉感知、声刺激和耳鸣三种状态下存在显著差异。耳鸣的特征是高连接性、中心化的网络，AKT1和TNF是其高排序枢纽节点，可能参与炎症信号、异常兴奋性和适应不良可塑性。这些发现为理解扣带回相关耳鸣苦恼的分子基础提供了新颖的候选靶点和机制线索。
