《International Journal of Molecular Sciences》：Common-Garden Transcriptomes Distinguish Leaf-Form-Associated from Site-Associated Expression in Zygophyllum xanthoxylum
霸王（Zygophyllum xanthoxylum (Bunge) Maxim.）是中国西北温带荒漠中一种优势的深根灌木，其小叶相对扁平宽大至细长圆柱状不等，但这种变异的分子基础鲜有报道。研究人员比较了来自三个不同荒漠生境的种质——一个采自荫蔽的高海拔河谷、叶片扁平，另两个采自开阔全日照位点、叶片棒状。这些种质在小叶叶片上存在差异，但叶柄无差异，其中扁平叶种质的叶片更短且宽得多，宽长比几乎是前者的四倍。研究人员组装了叶片转录组，并通过成对比较鉴定出数千个差异表达基因。叶形信号被定义为在两次扁平叶对棒状叶的比较中一致变化的基因，使扁平叶种质处于该序列的一端。该基因集包含一个相互作用的叶片发育模块：YABBY叶片基因YAB2、生长素/极性因子ARF3和ARF18以及扩张蛋白EXPA1在扁平叶种质中表达较高，而KNOX基因KNAT6、II类TCP基因TCP12、ARF6、EXPA4和ATHB7在两个棒状叶种质中表达较高。光合作用基因显著富集于扁平叶种质中表达峰值最高的表达簇中，其中捕光天线、光系统II和卡尔文循环转录本在该种质中表达量最高。叶绿素a-b结合蛋白CAB和胞质磷酸甘油酸激酶PGK是扁平叶偏向性最强的转录本，且在每种情况下，这种偏向性在整个基因家族中均成立；定量RT-PCR证实了基于测序的估算结果。因此，霸王中扁平叶与棒状叶的分化伴随着叶片发育和光捕获基因表达上组成性、协调性的差异，CAB和PGK被提议作为扁平叶形态的候选表达标记。
**霸王叶形分化的转录组学解析：同质园条件下的叶形相关与生境位点相关基因表达特征**
**1. 研究背景与科学问题**
叶片是植物捕获光能和进行气体交换的主要器官，其形态是植物最具可塑性且与适应性密切相关的重要性状之一。在干旱环境中，叶片大小与几何形态处于一个众所周知的权衡中心：宽大扁平的叶片能高效截获光能并支持高光合速率，但同时会暴露更大的表面积以应对蒸腾需求与热负荷；而狭窄、圆柱状或棒状的叶片则以牺牲光捕获面积为代价，换取更小的表面积与体积比、降低蒸腾作用并增强对高光强和干旱的耐受性。荒漠灌木常处于这一连续谱系的棒状叶端，向减小、圆柱状或鳞片状叶片方向的转变在向炎热、干燥、高光生境扩散的谱系中反复出现。
霸王（*Zygophyllum xanthoxylum* (Bunge) Maxim.）是分布于中国西北干旱荒漠及邻近中亚地区的深根、肉质叶灌木，是固沙与荒漠化防治的关键物种，同时也是重要的饲用和药用植物。其积累Na?、将Na?区隔化于液泡并在严重胁迫下维持有利水分状态的能力，使其成为盐旱耐受研究的模式植物。种内不同生境的个体在叶形上存在显著差异，从相对扁平宽大到细长棒状。这种种内变异提供了一个天然实验：具有相同物种水平遗传背景但源自不同环境的植株，通过比较可鉴定伴随叶形分化及其相关生理策略的基因表达变化。
叶片形态的遗传控制在模式物种中已有大致轮廓：叶片扁平化依赖于近-远轴极性的建立，III类HD-ZIP转录因子（如REVOLUTA和ATHB15/CORONA）指定近轴身份，KANADI和YABBY因子指定远轴身份并驱动叶片伸展，两个结构域的并置是扁平叶片形成所必需的。在此框架之上，I类KNOX基因维持未定型、分生组织状态，必须在叶原基中关闭才能发育出定型、扁平的叶片；生长素通过ARF3/ETTIN等AUXIN RESPONSE FACTOR参与叶缘模式形成并强化极性。最终叶片大小由II类TCP因子（抑制增殖）与GROWTH-REGULATING FACTOR及细胞壁松弛扩张蛋白（驱动增殖和扩展）之间的平衡决定。然而，这一保守工具包如何被部署以产生荒漠灌木霸王中观察到的扁平叶与棒状叶的对比，此前尚未被研究。
**2. 研究目标与设计**
本研究比较了霸王三个种质——一个扁平叶（采自荫蔽高海拔河谷的Guide种质）和两个棒状叶（采自开阔全日照位点的Korla和Wensu种质）——在统一同质园条件下从种子共同培育，并通过从头叶片转录组测序进行分析。由于种质在源生境恶劣程度和叶形上均存在差异，两种效应在任一成对比较中叠加，研究人员因此将差异表达基因划分为一个叶形轴和两个生境位点轴后再进行解读。研究目标包括：（i）量化种质间的形态分化；（ii）描述种质间的整体转录差异；（iii）从位点轴中解析叶形轴，并鉴定与各轴相关的叶片发育和光合作用基因；（iv）提名扁平叶形态的候选表达标记。
**3. 主要技术方法**
研究人员获取了来自昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库的三个霸王种质。种子形态通过测量100粒/种质的纵横轴长度和千粒重，并几何推算投影面积、体积和密度进行分析。幼苗在统一光照、温度和浇水条件下同质园培育，移栽30天后对每株取一个完全展开叶片测量小叶叶片和叶柄的长宽及宽长比。九个叶片文库（3种质×3生物学重复）经Illumina HiSeq 2000平台双端测序，用Trimmomatic过滤后用Trinity v2.4.0混合组装、Corset v1.06聚类为118,214个基因，BUSCO评估完整性达99.5%，DIAMOND/BLAST+比对NR、Swiss-Prot、KOG、NT数据库进行功能注释，RSEM定量表达。DESeq2 v1.22.2进行三种成对比较的差异表达分析（|log2倍变化|≥2，校正p<0.01），并按设计轴将DEGs划分为叶形相关（进一步分为叶形特异和叶形梯度）、Korla特异、Wensu特异和Korla极端等集合。k-means聚类（k=6）进行共表达分析。对光合作用、叶片发育和角质层/水分关系三个基因集进行人工精选注释。用qPCR对四个跨越大范围倍变化的DEGs进行技术验证。
**4. 主要研究结果**
**4.1 三个种质来自对比生境且在种子大小和紧实度上存在差异**
三个来源点跨越清晰的环境梯度。Guide位于约2660 m的最高海拔，植株生长在人工林冠层荫蔽下、光照相对较低；两个新疆位点海拔较低且完全暴露于阳光下。大陆性程度与海拔相反，Korla年温度范围约37°C、Wensu约33°C，而Guide约24°C。种子形态追踪了这一对比：千粒重在各种质间几乎相同（均接近14 g），但Guide产生最大的种子（8.63×3.36 mm），投影面积和估算体积最大（体积跨度1.6倍），密度最低；Korla种子密度最高。因此，扁平叶高海拔种质产生更大、密度更低的种子，而棒状叶干旱种质产生更小、密度更高的种子。
**4.2 小叶叶片而非叶柄在同质园条件下区分扁平叶与棒状叶种质**
从种子并排生长时，30天后叶形差异明显：Guide着生扁平宽小叶，而Korla和Wensu产生细长圆柱状小叶。形态测量将对比定位于叶片：叶柄在长度、宽度或宽长比上无种质差异；小叶叶片差异显著——Guide叶片更短（2.15 cm对3.90和4.30 cm）但更宽（0.55 cm对0.27和0.30 cm），宽长比25.6%比Korla的6.9%和Wensu的7.0%高3.7倍。两个棒状叶种质间无差异。由于所有植物在相同条件下培育，这一差异是组成性的。
**4.3 完整的从头参考和可重复的文库**
九个叶片文库获得42.1–5190万原始和32.7–5090万洁净双端读段。混合组装和Corset聚类产生118,214个基因、跨度163.7 Mb，平均长度1385 bp，N50为1993 bp。BUSCO在425个单拷贝直系同源组中恢复423个为完整，表明基因空间代表基本完整。功能注释在至少一个数据库中分配了78.9%的基因。
**4.4 Korla种质在全转录组范围最发散，DEGs以调控、信号转导和转运功能为主**
重复文库可重复，种质间Guide和Wensu构成最相似对，Korla与两者均明显分离。Guide对Wensu DEGs最少（2697），Korla对Wensu居中（2858），Guide对Korla最多（4219）。跨三个比较共7155个不同DEGs，92.0%带有功能注释。121个基因在所有三个比较中均差异表达。全局转录发散主要由极端生境Korla种质的独特性而非叶形决定。
DEGs以调控和转运功能为主。蛋白激酶和信号转导基因在每个比较中构成最大类别，其次是转录因子、转运、胁迫与防御、激素信号、细胞壁、角质层与蜡质、次生代谢和光合作用。419个DEG编码转录因子中WRKY家族最大，其次为bHLH、AP2/ERF、NAC和MYB。GO和KEGG富集显示三个比较均富集化学、内源、激素和外部刺激响应条目，次生代谢物生物合成和一般代谢途径始终为两个主要KEGG途径，而光合作用相关途径仅出现在涉及扁平叶Guide种质的比较中。
**4.5 转录变异解析为一个叶形轴、两个位点轴和六个共表达簇**
由于Korla主导全局信号，叶形对比无法从任何单一成对比较中直接读取。叶形相关基因集（在Guide对Korla和Guide对Wensu两次比较中以相同方向差异表达，使扁平叶种质相对两个棒状叶种质处于一端）包含971个基因，363个在扁平叶Guide中较高，608个在两个棒状叶种质中较高。其中907个为叶形特异（Korla与Wensu间无残余差异），64个为叶形梯度（保持相同扁平对棒状方向且两个棒状叶种质量级也不同）。Korla特异集含1121个基因（793个在Korla较高，328个较低），Wensu特异集含349个基因，另有57个为Korla极端基因（三个比较均差异表达且Guide介于两个棒状叶种质之间）。
两个大集的功能内容不同。相对剩余DEGs，Korla特异集显著富集胁迫与防御、转运、转录因子和次生代谢基因，而叶形特异基因显示出相反趋势，显著消耗胁迫与防御基因及激酶和信号基因。因此追踪叶形的基因不是胁迫特征，区分最恶劣位点的基因也不是叶形特征。
无监督视图与上述划分一致。4185个DEGs解析为六个共表达簇：C1（Guide高，n=620）和C2（Guide高、Wensu低，n=517）在扁平叶Guide中峰值，C3（Korla低，n=488）在Guide和Wensu中相似表达，C4（Korla高，n=1282，最大簇）、C5（Wensu高，n=515）和C6（Guide低、两个棒状叶种质均高，n=763）在一个或两个棒状叶种质中峰值。光合作用基因在C3和C1中最常见、在C4和C6中最少，而转录因子、激酶、胁迫和次生代谢基因集中于C4和C6。半数光合作用DEGs位于仅占总DEGs约四分之一的C1和C3中，并相应地从Korla高和棒状叶高簇C4和C6中消耗。角质层、水分关系、干旱、水通道蛋白和蜡质合成基因无此偏向。
**4.6 一个相互作用的叶片发育模块追踪扁平对棒状对比**
挖掘叶片发育家族产生一个连贯的相互作用模块。四个基因在扁平叶Guide种质中显著高于两个棒状叶种质：YABBY叶片基因ZxYAB2（从Guide中72个标准化计数降至任一棒状叶种质中不到6个）、生长素/极性因子ZxARF3（ETTIN）和ZxARF18以及细胞壁松弛扩张蛋白ZxEXPA1（从213个计数降至不到二十个）。六个基因显示相反的棒状叶高模式：I类KNOX基因ZxKNAT6在扁平叶Guide中最低并在两个棒状叶种质中强烈升高（从约4个计数升至Korla 150个和Wensu 27个）；II类TCP因子ZxTCP12、ZxARF6、扩张蛋白ZxEXPA4、HD-ZIP I因子ZxATHB7和器官边界基因ZxLBD38同样棒状叶高。所有十个基因在两次扁平对棒状比较中一致变化，其中九个满足叶形相关集的形式标准（八个叶形特异，ZxKNAT6为叶形梯度——两次比较中均棒状叶高并在Korla达到最大值）。
并非每个经典极性基因都追踪叶形，例外情况清晰映射到位点轴。III类HD-ZIP近轴极性因子ZxATHB15在Guide和棒状叶Wensu中均高、仅在Korla中降低，将其置于Korla特异集而非叶形集。因此这些种质的扁平对棒状差异不伴随III类HD-ZIP表达的简单丢失，而是与特定的YABBY–ARF–扩张蛋白模块相对KNOX、TCP和LBD活性相关。
**4.7 光合作用基因表达在亚途径间重新分配，天线转录本、CAB和PGK在扁平叶种质中最高**
102个DEGs编码光合机构的质体靶向组分，分布于八个亚途径。捕光天线最为突出，其在Guide中的平均表达超过任一棒状叶种质约一个数量级。光系统II、卡尔文循环碳固定和类囊体组织也在Guide中峰值，而光系统I、细胞色素b6f和叶绿素生物合成在Wensu中峰值，铁氧还蛋白/NDH在Korla中峰值。因此八个亚途径中四个在Guide中峰值、三个在Wensu中、一个在Korla中——差异是装置组分间的重新分配而非统一上调或下调。相对Korla，光合作用DEGs在Guide和Wensu中均强烈偏向上调，而Guide和Wensu彼此平衡。碳固定因此更适合描述为Korla低而非扁平叶高，而天线信号特异于扁平叶种质。
两个转录本最强地携带扁平叶信号：叶绿素a-b结合蛋白ZxCAB在Guide中表达628个标准化计数，对应Korla中9个和Wensu中39个；胞质磷酸甘油酸激酶ZxPGKc为3286对556和62。最丰富的天线转录本ZxLHCB1在远高得多的水平上遵循相同方向。三者均属于叶形相关集，均为叶形梯度。跨所有39个量化成员总计，叶绿素a-b结合蛋白总丰度在Guide中比Korla高4.8倍、比Wensu高16.7倍；所有三个量化的胞质磷酸甘油酸激酶簇均在Guide中最高。CAB和PGK的扁平叶偏向因此是整个基因家族的特性而非单个组装簇的产物。
**4.8 qPCR确认表达估算并说明位点轴**
对四个跨越宽倍变化范围的DEGs进行qPCR，使用与测序文库相同总RNA制备的cDNA——这是对量化的技术确认而非独立生物学验证。跨12个基因×比较点，两种平台紧密相关并在每个点方向一致。RNA-seq报告更大的绝对倍变化，反映其更宽的动态范围。约16个log2单位的吻合表明定量流程能准确报告表达差异。四个基因均在来自最恶劣位点的种质中峰值，其注释明确属于非生物胁迫分支：ABCG/PDR转运蛋白输出蜡质和角质前体至角质层、CP1结合离子和渗透胁迫产生的Ca2?信号、MYB4是胁迫响应和次生代谢基因的转录调控因子、PR-4是分泌的几丁质酶样防御蛋白。它们在最低、最亮、大陆性最强的种质中在同质园条件下协调上调，将转录组的位点轴与该源生境的干旱、盐度和高光胁迫联系起来。
**5. 讨论与结论**
三个种质从种子同园培育，因此记录的差异是植物携带的特性而非对来源环境的响应。这些差异不构成单一梯度，而是解析为两个大致独立的轴：一个追踪叶形、将扁平叶Guide种质与两个棒状叶种质分开并局限于小叶叶片而非叶柄；另一个追踪来源位点、几乎完全由Korla种质的独特性驱动。任一轴都无法孤立看到，因为任何成对比较都同时移动两者。
叶形轴上的基因在注释和表达差异方向上与模式物种建立的叶片扁平化途径紧密对应。扁平、近-远轴叶片需要近-远轴极性、叶片伸展和持续增殖，扁平叶种质在所有三个过程中均上调——促进叶片的YABBY基因ZxYAB2、生长素/极性因子ZxARF3（ETTIN）和ZxARF18及细胞壁松弛扩张蛋白ZxEXPA1。与它们相反并在两个棒状叶种质中较高的是ZxKNAT6、ZxTCP12、ZxLBD38、ZxARF6、ZxEXPA4和ZxATHB7。每个方向都是预期的：KNOX活性必须在原基形成前被排除才能形成定型、扁平的叶片；II类TCP因子抑制叶片增殖；LBD基因在器官边界起作用。对ZxKNAT6需加注意，因为在拟南芥中KNAT6主要在器官边界起作用而非分生组织维持本身。
一个经典基因不遵循叶形，这反而更具信息量。ZxATHB15（III类HD-ZIP）在Guide和棒状叶Wensu中均高、仅在Korla中降低，因此追踪位点而非叶形。若与其他基因合并，它看起来会与极性模型矛盾；解析到位点轴上，则表明这些扁平与棒状叶之间的差异不是III类HD-ZIP极性的简单丧失，而是与上述YABBY–ARF–扩张蛋白模块相关。
同一轴上携带了更大的光合作用信号：整个装置的表达在扁平叶种质中最高、在最极端的种质中最低，但亚途径并非同步升降。碳固定更适合描述为Korla低而非扁平叶高，因为Guide和Wensu处于相当水平，且几个亚途径在Wensu中峰值。将这些搁置后，捕光天线就是叶形轴上剩余的部分。该天线信号有三个可解释的特征：非常大（ZxCAB和ZxPGKc比两个棒状叶种质高一至两个数量级）；在整个叶绿素a-b结合蛋白家族水平上成立（排除单个异常重叠群或组装伪迹）；独立于植物生长的光照条件（排除直接光响应）。在单一光照制度下生长，它反映的是每个种质构建多少光捕获机构的组成性差异。更宽、更扁平的叶片和对其填充机构更大的投资属于功能上是截获光而非散失光的叶片。第二个标记从无关方向汇合到相同结论：胞质磷酸甘油酸激酶不属于卡尔文循环，而属于碳代谢的胞质臂，作用于从叶绿体输出的三碳糖磷酸下游。其家族级扁平叶偏向因此补充而非重复天线信号，两者共同提供了可在更多个体和群体中检验的紧凑表达特征。
位点轴具不同特征，一个种质占了大部分。无论数据如何划分——相关结构、最大DEG比较、最大共表达簇和qPCR面板——Korla均作为离群值出现，而Korla也是气候最严酷的位点。区分它的1121个基因富集胁迫与防御、转运、转录因子和次生代谢功能，角质层、水分关系和干旱基因朝同方向移动。qPCR检测的四个基因具体说明了该程序：输出蜡质和角质前体的ABCG/PDR转运蛋白、作用于胁迫和次生代谢基因上游的MYB因子、响应离子胁迫的Ca2?结合蛋白和分泌的PR-4防御蛋白。同质园中不存在能解释该程序的任何胁迫，程序却仍被表达，因此在这些种质中是组成性的，并在会引发它的胁迫缺失时维持。
综合来看，两个轴描述的不是独立性状列表而是两种协调策略。来自遮蔽、荫蔽、热适中位点的种质将扁平宽叶片与高光捕获投资及更大、密度更低的种子结合；两个来自低海拔、暴露、强大陆性位点的种质将棒状叶片与偏向胁迫和转运的转录组及更小、密度更高的种子结合。种子对比是轻微的——千粒重几乎不变，只有紧实度改变——但方向与叶片和转录组对比一致而非相反。这些数据无法确定性状是遗传耦合还是仅被共同选择。同质园设计确实确立的是：整个组合而非其中任何单一性状在种群间存在差异，而种群间有差异的组合正是选择可作用的组合。
两点框定这些结果。叶形轴由对照两个棒状叶种质的单一扁平叶种质定义，因此是与扁平对棒状对比相关的表达模式而非显示为决定霸王叶形的基因集；恢复的基因正是模式物种叶片扁平化途径所预测的且以预测方向变化，为这种关联提供了生物学支持。模块成员因此是与扁平叶表型相关的候选基因。同质园设计同样确立了形态和转录差异在植物远离来源环境生长时仍维持，排除了对当前条件的直接可塑性响应，尽管它本身不能确立这些是那些环境的遗传适应。两点都通过扩展到额外的独立扁平叶和棒状叶种质来最直接地解决，本研究报告的模块为此提供了紧凑的候选集。
研究结论：霸王三个生境分化种质从种子同园培育，在叶形上组成性差异——来自荫蔽高海拔河谷的种质叶片扁平宽大，两个来自干旱全日照位点的种质叶片窄而棒状——而叶柄保守。从头转录组比较表明这种对比伴随协调的表达差异。一个相互作用的叶片发育模块（叶片相关基因YAB2、ARF3、ARF18和EXPA1与棒状叶相关基因KNAT6、TCP12、ARF6、EXPA4、ATHB7和LBD38相对抗）追踪扁平对棒状对比，光合作用基因表达显著集中于序列的扁平叶端并在亚途径间重新分配，捕光转录本丰度在扁平叶种质中高4.8至16.7倍（整个基因家族水平）。第二个位点相关轴将来自最恶劣生境的种质区分开，富集胁迫、转运、调控和次生代谢基因，包括qPCR确认的四个基因；将该轴与叶形轴分离是正确解读转录组所必需的。这些结果为霸王扁平对棒状小叶分化的首个分子画像，并鉴定CAB和PGK连同YAB2、KNAT6及相关叶片发育基因为与扁平叶表型相关的候选基因，有待在额外独立扁平叶和棒状叶种质中及通过功能研究进行检验。
