类风湿关节炎循环CD4+CD28? T细胞与NK细胞中细胞毒性相关标志物的差异表达研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Differential Expression of Cytotoxic-Associated Markers in Circulating CD4+CD28? T Cells and NK Cells in Rheumatoid Arthritis

　　

类风湿关节炎（RA）涉及细胞毒性淋巴分化的改变，然而循环辅助性T细胞和自然杀伤（NK）细胞的精确表型重塑仍未完全阐明。研究人员采用多参数流式细胞术，在28例女性RA患者和12例年龄匹配的健康女性对照中，评估了循环CD4+CD28+和CD4+CD28? T细胞亚群、NKG2A+CD56+ NK细胞，以及颗粒介导的细胞毒性标志物（颗粒酶B和穿孔素）和表面结合的死亡受体Fas配体（FasL）的表达。与对照组相比，RA患者中CD4+CD28?细胞比例升高（占CD4+细胞的16.6%对6.5%）。在CD4+CD28?细胞中，RA患者颗粒酶B阳性率显著降低（5.0%对62.0%），而FasL表达升高（40.3%对22.5%）。RA患者还表现出更高比例的循环NKG2A+CD56+ NK细胞（占PBMC的6.1%对2.7%），且其颗粒酶B表达显著降低（8.4%对55.6%）。较高的疾病活动度（DAS28-CRP）与NKG2A+CD56+ NK细胞总频率、CD4+CD28+ T细胞和NKG2A+CD56+ NK细胞中穿孔素的胞内表达呈正相关，并与CD4+CD28?细胞中较低的FasL表达相关。这些发现支持RA中循环细胞毒性标志物存在疾病相关的表型重塑，其特征为CD4+CD28? T细胞和NKG2A+CD56+ NK细胞中颗粒酶B和FasL表达发生转变，但这些表达谱是否转化为细胞毒性动力学的改变仍有待功能学验证。

论文解读

一、研究背景与目的

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以持续的免疫激活导致滑膜炎症、进行性关节破坏及多种关节外表现为特征。RA的发病涉及遗传易感性、环境触发因素与免疫耐受丧失之间的复杂相互作用，其核心机制之一在于适应性免疫应答的异常激活，尤其是CD4+ T细胞通过产生干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-17（IL-17）和IL-6等细胞因子，与髓系细胞和基质细胞发生动态串扰，从而驱动炎症级联反应。

在RA中已报道的T细胞异常中，缺乏共刺激分子CD28表达的循环CD4+ T细胞（即CD4+CD28?细胞）的扩增一直与疾病严重程度相关。然而，CD4+CD28?细胞并非一个独立的免疫学谱系，而是在慢性抗原刺激下产生的、具有表型定义的异质性细胞群，包含不同分化与活化阶段的细胞，表现出不同程度的衰老、耗竭、细胞毒性潜能以及NK相关特征的获得。尽管CD4+CD28?细胞表达穿孔素和颗粒酶等细胞毒性分子，并已被认为与RA中加速的动脉粥样硬化和心血管风险增加有关，但其生物学和功能异质性仍未完全阐明。

与此同时，RA中CD4+ T细胞获得细胞毒性表型的这一致病性变化，与固有淋巴群尤其是NK细胞的表型转变相呼应。现有证据表明，滑膜NK细胞可能通过产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）等炎症介质加重关节炎，而外周NK细胞则可能通过IFN-γ产生和对致关节炎免疫细胞的细胞毒性发挥保护作用。然而，越来越多的证据表明，外周NK细胞群在活动性疾病期间发生深刻的功能变化；外周NK细胞频率降低和活性减弱与较高的疾病活动度和全身性炎症直接相关。此外，近期表型分析显示，外周NK细胞上穿孔素和颗粒酶B等颗粒相关细胞毒性介质的下调与严重临床表型（包括骨畸形和侵蚀性疾病）相关。

然而，尽管多项研究报告了CD4+CD28? T细胞内细胞毒性相关分子表达增加，但RA中这些标志物的全面表型分布尚未被充分表征。特别是与颗粒介导的细胞毒性相关的分子（包括穿孔素和颗粒酶B）以及死亡受体介导通路相关分子（如Fas配体，FasL）在该群体中的表达模式仍探索不足。值得注意的是，这些分子的表达不应被解释为细胞毒性功能的直接证据，因为它们可能反映不同的活化状态或功能耗竭，并不一定预示明确的靶细胞杀伤。尽管如此，对其表达谱的全面表征可能为了解CD4+CD28?区室的表型特征提供见解，并为其在疾病发病机制中的潜在贡献生成假说。

基于上述背景，本研究旨在通过多参数流式细胞术，对RA患者和健康对照者中循环CD4+CD28+和CD4+CD28? T细胞亚群及NKG2A+CD56+ NK细胞的颗粒酶B、穿孔素和FasL表达进行比较性表型表征，并探讨这些协调的表型特征与临床疾病活动度之间的关联。

二、研究设计与主要结论

本研究为一项观察性横断面研究，纳入28例符合2010年美国风湿病学会/欧洲风湿病联盟（ACR/EULAR）RA分类标准的女性患者，以及12例年龄匹配的健康女性对照。为排除生物学性别对疾病活动指数和外周免疫细胞计数的潜在混杂影响，研究仅纳入女性参与者。RA患者的中位年龄为51岁（四分位距40–55），健康对照为47岁（四分位距38–51）。RA队列的中位病程为6.5年。合并症方面，系统性高血压和2型糖尿病各占25%，干燥综合征占17%。RA患者中位高敏C反应蛋白（hsCRP）为4.93 mg/L，中位红细胞沉降率（ESR）为8.5 mm/h。类风湿因子（RF）检出率为75%，抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）检出率为64%。患者接受的治疗包括传统合成改善病情抗风湿药（csDMARDs，主要为甲氨蝶呤78%和柳氮磺吡啶60%）、糖皮质激素（14%）、生物制剂DMARDs（bDMARDs，10%）和靶向合成DMARDs（tsDMARDs，17%）。

研究的主要结论为：RA与循环CD4+CD28?细胞和NKG2A+CD56+ NK细胞频率增加相关，同时伴随两个细胞区室内细胞毒性相关标志物表达模式的深刻改变。与健康对照相比，RA患者的CD4+CD28? T细胞和外周NKG2A+CD56+ NK细胞表现出显著降低的胞内颗粒酶B表达；相反，CD4+CD28? T细胞池中FasL表面表达显著上调，而穿孔素表达在两个谱系中基本保持。这些发现确定了RA中循环固有和适应性细胞毒性群体存在独特的平行表型重塑，探索性分析进一步提示这些表达谱随临床疾病活动度发生协调性转变。其重要意义在于揭示了RA中颗粒介导的细胞毒性机制与死亡受体介导通路之间存在疾病相关的表型分歧，为理解RA的免疫病理机制提供了新的视角。

三、关键技术与方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：研究队列来源于墨西哥Ignacio Chávez国家心脏病学研究所附属大学医院三级转诊中心，连续纳入符合ACR/EULAR标准的RA女性患者及年龄匹配的健康女性对照。外周血样本经乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采集后，采用Histopaque-1077密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）。免疫表型分析采用多参数流式细胞术，使用经预先滴定的荧光素偶联单克隆抗体进行表面染色，包括CD4（BUV737）、CD28（PE）、CD56（FITC）、FasL/CD178（BV421）和NKG2（BV605），随后使用IC固定/透化试剂盒进行固定和透化，再进行穿孔素（AF488）和颗粒酶B（AF647）的胞内染色。流式数据采集使用BD FACSAria Fusion流式细胞仪，以FACSDiva软件v.9.7收集数据，FlowJo软件v.10.10.1进行分析。门控策略为：先以FSC/SSC特征识别淋巴细胞并排除双联体，随后圈定CD4+CD56?辅助性T细胞群并依据CD28表达区分为CD4+CD28+和CD4+CD28?亚群，同时在同一单细胞门内以NKG2A+CD56+定义NK细胞群；各细胞毒性标志物的边界门严格依据相应的未染色对照和荧光减一（FMO）对照确定。临床疾病活动度采用三变量28关节疾病活动度评分（DAS28-CRP）评估，并以3.0分为界进行低/高疾病活动度的分层分析。统计分析采用非参数检验（Mann–Whitney U检验、Kruskal–Wallis检验及Dunn多重比较校正、Fisher精确检验），相关性分析采用Spearman秩相关系数，多重比较校正采用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）程序。

四、研究结果

4.1 研究人群

共纳入28例女性RA患者和12例年龄和性别匹配的健康对照。两组中位年龄相当（RA为51岁，对照为47岁，p=0.360）。RA队列中位病程6.5年。高血压和2型糖尿病各占25%，干燥综合征占17%。RA患者中位hsCRP为4.93 mg/L，中位ESR为8.5 mm/h，RF检出率75%，ACPA检出率64%。患者接受的治疗包括csDMARDs（甲氨蝶呤78%、柳氮磺吡啶60%）、糖皮质激素（14%）、bDMARDs（10%）和tsDMARDs（17%）。

4.2 RA中循环CD4+ T细胞亚群和NKG2A+CD56+ NK细胞频率改变

PBMC中总T细胞比例在两组间相当（24.8%对27.9%，p=0.615），CD4+ T细胞占总T细胞比例也无显著差异（41.6%对37.4%，p=0.647）。然而，RA患者中CD4+CD28+ T细胞频率显著降低（83.3%对93.4%，p=0.002），而CD4+CD28? T细胞亚群显著扩增（16.6%对6.5%，p=0.002）。NKG2A+CD56+ NK细胞占PBMC的百分比在RA组显著升高（6.1%对2.7%，p=0.023）。

4.3 CD4+ T细胞亚群和NKG2A+CD56+ NK细胞中细胞毒性相关标志物的差异表达

在健康个体中，CD4+CD28? T细胞占循环CD4+细胞的中位比例为6.5%，其颗粒酶B阳性（62.0%对5.0%，p=0.012）、穿孔素阳性（6.6%对0.3%，p=0.003）和FasL阳性（22.5%对12.3%，p=0.012）细胞比例均显著高于CD4+CD28+亚群。RA患者中，CD4+CD28?亚群扩增至占CD4+ T细胞的16.6%，同样含有显著更高比例的颗粒酶B阳性（5.0%对0.8%，p=0.001）、穿孔素阳性（6.7%对0.7%，p=0.002）和FasL阳性细胞（40.3%对10.8%，p<0.001）。组间直接比较显示：在CD4+CD28+区室内，RA患者的颗粒酶B阳性比例较低（0.8%对5.0%，p=0.001），穿孔素阳性比例略高（0.7%对0.3%，p=0.042），FasL表达无显著差异。在CD4+CD28?区室内，RA患者的颗粒酶B阳性率显著低于健康对照（5.0%对62.0%，p<0.001），穿孔素阳性率相当（6.7%对6.6%，p=0.872），而FasL阳性率显著升高（40.3%对22.5%，p=0.048）。在NKG2A+CD56+ NK细胞区室中，RA患者的颗粒酶B表达显著低于健康对照（8.4%对55.6%，p<0.001），而穿孔素（5.0%对6.7%，p=0.790）和FasL（91.8%对95.9%，p=0.497）阳性率在两组间相似。

4.4 按疾病活动度的探索性分析

按DAS28-CRP分层后，低疾病活动度组（中位DAS28-CRP=1.9）的CD4+CD28+ T细胞颗粒酶B阳性比例显著高于高疾病活动度组（中位DAS28-CRP=3.9）（1.2%对0.2%，p=0.021）。高疾病活动度组在CD4+CD28+亚群（6.0%对0.5%，p=0.038）和CD4+CD28?亚群（18.3%对3.9%，p=0.018）中的穿孔素阳性细胞比例均更高。此外，高疾病活动度组的CD4+CD28?细胞FasL阳性频率显著低于低疾病活动度组（21.4%对44.7%，p=0.043）。NKG2A+CD56+ NK细胞区室在低和高疾病活动度组之间未观察到显著差异。Spearman相关分析显示，DAS28-CRP与CD4+CD28+ T细胞内穿孔素表达（ρ=0.406，p=0.031）和NKG2A+CD56+ NK细胞内穿孔素表达（ρ=0.439，p=0.019）呈显著正相关，也与循环NKG2A+CD56+ NK细胞总频率呈正相关（ρ=0.385，p=0.043）。经Benjamini–Hochberg校正后，DAS28-CRP与CD4+CD28+ T细胞穿孔素表达的关联仍显著（FDR校正p=0.047），与NKG2A+CD56+ NK细胞穿孔素表达的关联接近但未达预设FDR阈值（FDR校正p=0.057）。

五、讨论总结与结论

讨论部分指出，RA中CD4+CD28?细胞和NKG2A+CD56+ NK细胞频率增加，伴随两个区室内细胞毒性标志物表达模式的深刻改变。与健康对照相比，RA的CD4+CD28? T细胞和外周NKG2A+CD56+ NK细胞表现出显著降低的胞内颗粒酶B表达，而CD4+CD28? T细胞池中FasL表面表达显著上调，穿孔素表达在两个谱系中基本保持。这种适应性免疫和固有免疫区室中的平行表型重塑提示RA中存在共享的系统性颗粒介导细胞溶解机制失调。研究提出了几种非互斥的可能机制：慢性持续抗原和炎症刺激可能触发反复低水平脱颗粒，导致胞内颗粒酶B储存的耗竭；外周血与靶组织之间的趋化重编程可能导致富含颗粒酶B的高细胞毒性效应细胞优先迁移至发炎滑膜，在外周留下颗粒酶B耗竭和功能耗竭的细胞；TNF和IL-6主导的细胞因子环境可能转录或翻译后影响这些效应通路，选择性上调FasL作为替代性非分泌型细胞毒性机制。关于穿孔素，尽管未校正分析提示潜在趋势，但经多重检验校正后无法确认全身性炎症负担与胞内穿孔素负荷之间存在稳健的连续相关性，提示穿孔素合成与当前全身性炎症的动力学紧密耦合，而颗粒酶B动力学由慢性长期细胞耗竭决定。讨论还承认了治疗的混杂影响，以及研究的局限性，包括横断面设计、样本量有限、治疗异质性、缺乏功能学检测以及仅纳入女性参与者。

研究结论为：RA与循环免疫细胞群的显著平行重塑相关，其特征为CD4+CD28? T细胞和NKG2A+CD56+ NK细胞的扩增。这种系统性改变以选择性下调胞内颗粒酶B同时保持穿孔素表达为标志，并伴随CD4+CD28? T细胞区室内表面FasL的显著上调。这些发现提示循环中内部颗粒成分与表面死亡受体配体之间存在疾病相关的表型分歧。由于未进行功能性细胞溶解检测，这些模式反映的是结构性细胞重塑而非分泌或杀伤能力的确定性转变。未来需要功能学检测以充分阐明这种细胞毒性失调在RA发病机制中的转化意义。