《International Journal of Molecular Sciences》：TENASCIN-Dependent Mesenchymal–Epithelial Interactions Associated with Interstitial Microenvironment Remodeling in Cattle-Yak Lung: Insights from Single-Nucleus Transcriptomics
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犏牛是牛与牦牛的杂交后代，具有较高的产奶量、较快的生长速度以及对高海拔环境的强大生理适应能力，因而具有重要的商业价值。然而，犏牛低氧适应在单细胞核水平的转录组基础仍未得到充分解析。研究人员对超过20,000个细胞进行了分析，并鉴定出代表牦牛和犏牛主要肺细胞类型
犏牛是牛与牦牛的杂交后代，具有较高的产奶量、较快的生长速度以及对高海拔环境的强大生理适应能力，因而具有重要的商业价值。然而，犏牛低氧适应在单细胞核水平的转录组基础仍未得到充分解析。研究人员对超过20,000个细胞进行了分析，并鉴定出代表牦牛和犏牛主要肺细胞类型的亚群。与牦牛相比，犏牛肺中间质细胞比例更高。肺泡成纤维细胞、肺泡脂成纤维细胞和导管肌成纤维细胞表达的Tnc配体，通过TENASCIN信号通路与上皮细胞Itgav+Itgb6和Itgav+Itgb3受体相互作用，可能有助于犏牛的肺形态发生。这些发现提示，犏牛具有更强的肺间质重塑能力，这可能构成其在维持生长和生产性能的同时适应高海拔低氧的杂种优势基础。此外，研究人员还鉴定了与肺间质细胞重塑及肺组织差异相关的基因。本研究首次描绘了犏牛肺细胞类型的分子特征，填补了牦牛与犏牛肺组织比较性单核分析的空白。总之，这些结果加深了对高海拔牛品种高原适应的理解，并为这类环境中的畜牧业提供了有价值的信息。
单核转录组学揭示犏牛肺间质重塑与TENASCIN信号介导的间质–上皮互作
青藏高原具有低氧、低温和强紫外辐射等极端环境特征，其中低氧是持续而稳定的选择压力。牦牛作为青藏高原特有的大型哺乳动物，经历了长期低氧适应，肺血管发育良好、氧交换效率高；而普通牛在海拔2500米以上会出现生产力显著下降。牦牛与普通牛可杂交产生犏牛，犏牛在产奶量、生长速度和高原适应能力上均表现出杂种优势，但其单细胞核水平的低氧适应转录组基础尚不清楚。肺是机体与外界环境交换气体的主要界面，在高原适应中起核心作用。既往研究虽已建立牦牛和普通牛肺组织的单细胞图谱，但犏牛肺在单核分辨率下的细胞组成和基因表达动态仍属空白。为此，研究人员利用单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）构建牦牛与犏牛肺的单核图谱，旨在解析犏牛肺间质微环境重塑及其高原适应机制。
在技术方法上，研究人员从甘肃甘南海拔3000米处采集3头成年雄性牦牛和3头成年雄性犏牛（4–6岁）的肺组织，每组各取等量组织混合制备样本。通过10x Genomics Chromium平台构建snRNA-seq文库，使用Cell Ranger软件比对到BosGru 3.0参考基因组并生成基因表达矩阵；在R环境中用Seurat包进行质控、标准化和降维聚类，并用Harmony消除批次效应。通过Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）和细胞标记基因；利用g:Profiler进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析；使用CellChat推断配体–受体介导的细胞间通讯；对间质细胞亚群进行再聚类，并用Monocle 2进行拟时序分析。
2.1 基于snRNA-seq构建牦牛与犏牛肺单核图谱
研究人员对牦牛和犏牛肺组织进行snRNA-seq，经质控后共保留21,488个细胞，其中牦牛10,885个、犏牛10,603个。牦牛和犏牛的测序饱和度分别为76.7%和74.7%，基因组比对率分别为85.7%和84.5%，表明数据质量较高、测序深度达到饱和，适合后续分析。
2.2 细胞聚类与标记基因筛选
在0.5分辨率下进行UMAP聚类，牦牛和犏牛分别得到24个和25个细胞簇，其中簇24仅存在于犏牛。通过Wilcoxon秩和检验鉴定各簇DEGs，并利用热图和点图展示每个簇前五位高变基因的表达特征。
2.3 细胞类型鉴定
基于已发表标记基因注释，牦牛和犏牛肺中均鉴定出上皮细胞、内皮细胞、间质细胞、免疫细胞和未知细胞五类主要细胞类型。细胞频率比较显示，间质细胞比例差异最大：牦牛为8.1%，犏牛为12.7%。同时，间质细胞拥有的DEGs最多，共有1590个，提示间质细胞是牦牛与犏牛肺差异的关键细胞群体。
2.4 肺组织功能富集分析
GO富集分析显示，各细胞类型的富集功能与其身份一致：内皮细胞富集于细胞迁移调控和血管发育，上皮细胞富集于肌动蛋白丝相关过程和细胞突起组织，免疫细胞富集于免疫系统过程，间质细胞富集于解剖结构形态发生和细胞运动。对牦牛与犏牛间DEGs的富集分析表明，间质细胞DEGs主要富集于细胞蛋白质代谢过程。进一步通过STRING和Cytoscape分析，鉴定出ACTB、CTNNB1和UBB可能是间质细胞重塑的核心调控基因。
2.5 配体–受体分析揭示犏牛肺TENASCIN信号失调
CellChat分析显示，间质细胞与上皮细胞之间存在最强的细胞间通讯。与牦牛相比，犏牛中有22条信号通路的信息流显著增强。其中，TENASCIN信号被确定为核心候选通路：间质细胞表达的Tnc配体可与上皮细胞表面的Itgav+Itgb6和Itgav+Itgb3受体结合，提示TNC介导的间质–上皮互作可能参与犏牛肺形态发生和组织重塑。
2.6 间质细胞的潜在功能异质性
研究人员将间质细胞进一步分为7个亚型。亚型0和亚型2富集细胞迁移调控，亚型1富集多细胞生物发育，亚型3富集免疫系统过程，亚型4富集翻译和肽代谢过程，亚型5富集组织发育，亚型6富集血管发育。TNC在亚型0、2和5中高表达，分别对应肺泡成纤维细胞、肺泡脂成纤维细胞和导管肌成纤维细胞。
2.7 间质细胞代表性基因的拟时序表达模式
通过Monocle 2对2234个间质细胞进行拟时序分析，共鉴定出1234个动态表达基因，并划分为5种表达模式。其中，基因簇2的表达沿拟时序持续上调，富集于定位调控、刺激应答以及血管平滑肌收缩相关通路。进一步分析发现ACTB是潜在核心调控基因，提示其在间质细胞分化过程中发挥重要作用。
讨论部分指出，犏牛与牦牛肺中免疫细胞比例的差异可能与牦牛长期高原适应中炎症和免疫激活有关；犏牛特有的簇24被注释为杯状细胞。间质细胞DEGs富集的蛋白质代谢和形态发生过程，表明犏牛肺间质微环境重塑能力增强，这可能体现了杂种优势。TNC作为一种细胞外基质糖蛋白，可通过上皮–间质相互作用促进肺分支形态发生，为犏牛肺结构优化提供了分子基础。研究人员也指出研究局限性，包括生物重复有限、缺乏免疫荧光验证以及仅纳入雄性个体；未来研究引入普通牛对照将有助于进一步解析犏牛的杂种优势机制。
研究结论部分可翻译为：总之，本研究揭示了犏牛肺细胞的突出重要性以及牦牛与犏牛之间的差异，通过数百个关键基因精细绘制了犏牛肺的单核图谱，为未来犏牛肺研究提供了新途径和新方法。为阐明这些关键基因的功能并评估细胞重要性，仍需进一步深入的实验研究来探索其生物学作用。
