SLC35D1与结直肠癌进展、上皮-间质转化相关表型及免疫浸润的关联研究

《International Journal of Molecular Sciences》：SLC35D1 Is Associated with Colorectal Cancer Progression, EMT-Related Phenotypes, and Immune Infiltration

　　

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，转移性患者的预后仍然较差。溶质载体（solute carrier, SLC）蛋白参与多种细胞过程，然而SLC35D家族在CRC中的生物学及临床意义在很大程度上尚未被探索。本研究系统调查了SLC35D家族成员的表达模式及临床意义，并进一步评估了SLC35D1在CRC中的功能作用。研究人员利用TCGA及其他公开可用的数据集和分析平台进行生物信息学分析，以评估SLC35D家族成员在CRC中的表达模式及临床意义。研究检测了SLC35D1表达与患者生存、免疫细胞浸润、免疫检查点标志物及癌症相关转录程序之间的关联。研究人员在CRC细胞中进行功能缺失和功能获得实验，以评估SLC35D1对细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关表型的影响。SLC35D1表达在CRC组织中显著降低，SLC35D2呈不显著的下调趋势，而SLC35D3显著升高。在TCGA队列中，较低的SLC35D1表达与较差的临床结局相关，尽管这一预后关联未在独立的GSE39582队列中得到重现。生物信息学分析进一步揭示了SLC35D1表达与免疫细胞浸润、免疫检查点标志物及若干癌症相关转录程序之间的关联。尽管SLC35D1与EMT相关特征的关联较为温和，但通路富集分析提示其与EMT相关过程存在潜在联系。与这些观察一致，功能缺失和功能获得研究表明，SLC35D1表达与CRC细胞增殖、迁移、侵袭及EMT相关分子表型的变化相关。研究结果将SLC35D1确定为与CRC进展和临床结局相关的一个研究不足的SLC35D家族成员。功能研究表明，调节SLC35D1表达与CRC细胞恶性表型的变化相关，而其与EMT相关程序及肿瘤免疫微环境的关系有待进一步的机制研究。这些发现提示SLC35D1在CRC中可能具有预后意义，但其预后价值需在独立临床队列中进一步验证。

**SLC35D1在结直肠癌进展中的表达特征、临床意义及功能机制研究进展**

**一、研究背景与科学问题**

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球男性第三常见、女性第二常见的恶性肿瘤，且在台湾地区是年发病率持续上升的最常见癌症。CRC的发生发展是一个涉及遗传与环境因素交互作用的复杂多步骤过程，常见的基因突变和基因组不稳定与CRC密切相关。当前CRC的治疗手段主要包括手术、化疗和放疗，近年来靶向治疗和免疫治疗亦取得了进展。然而，转移性CRC患者的五年生存率仍低于20%。越来越多的证据强调了分子生物标志物在预后预测和治疗选择指导中的潜力，但许多标志物因验证不足或灵敏度、特异性有限而未能进入临床应用。因此，识别参与CRC恶性进展的更可靠的分子生物标志物，对于推动生物标志物驱动的个体化治疗至关重要。

溶质载体（solute carriers, SLCs）是人体基因组中最大的跨膜转运蛋白家族，包含400多个成员。尽管SLCs介导多种重要生物学功能，且其中若干成员是重要的药理学靶点，但相当比例的SLCs仍未被充分表征，其底物尚未被明确。SLCs功能失调与多种人类疾病相关，肿瘤细胞代谢重编程导致对碳水化合物、蛋白质、脂质和核酸的需求变化，而SLCs作为这些大分子的主要转运体，其表达也随之改变。因此，调控SLCs具有潜在的治疗策略价值。SLC35家族包含至少25个基因，分为七个亚家族，其功能是转运核苷酸糖，在细胞核或胞质中合成的活化糖与内质网（endoplasmic reticulum, ER）和/或高尔基体腔内的糖基转移酶之间发挥连接作用。SLC35D家族由SLC35D1-3三个成员组成。SLC35D1编码内质网核苷酸糖转运体（nucleotide-sugar transporter, NST），在硫酸软骨素生物合成中发挥重要作用，负责转运UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcUA）和UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺（UDP-GalNAc）。SLC35D2编码高尔基体定位的核苷酸糖转运体，UDP-N-乙酰-α-D-葡萄糖胺（UDP-GlcNAc）为其候选底物。SLC35D3除作为核苷酸糖转运体外，还参与脂肪沉积和代谢调控，并可通过促进BECN1-ATG14-PIK3C3复合物的形成诱导自噬。SLC35D1提供硫酸软骨素糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG）链合成所需的底物，这些GAG链被整合到细胞表面和细胞外基质蛋白聚糖中，GAG生物合成和组成的改变可影响细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的组织及其与细胞表面受体、细胞因子和生长因子的相互作用。肿瘤微环境中硫酸软骨素的丰度和组成改变与CRC进展（包括EMT相关改变和治疗反应）有关。然而，SLC35D1在CRC中的作用及其潜在分子机制在很大程度上仍未得到探索。因此，系统研究SLC35D家族在CRC中的表达和临床意义，并深入表征SLC35D1的功能，具有重要的科学价值。

**二、研究开展的主要内容与总体结论**

研究人员利用生物信息学方法（包括TCGA、GENT2、cBioPortal、Kaplan-Meier Plotter、PrognoScan、TIMER等数据库和平台）系统评估了SLC35D家族成员在CRC中的表达模式、遗传改变、临床意义及其与免疫浸润的关联；随后在CRC细胞系中通过短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）敲降和过表达实验，结合磺酰罗丹明B（sulforhodamine B, SRB）增殖实验、Transwell迁移与侵袭实验、集落形成实验、成球实验、实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫荧光等技术，评估了SLC35D1对CRC细胞增殖、迁移、侵袭及EMT相关表型的影响，并在GSE39582独立队列中验证了相关通路富集结果。研究发现SLC35D1在CRC组织中显著下调，并与不良临床病理特征及TCGA队列中较差的总体生存期相关；功能实验表明SLC35D1表达下调与细胞增殖、迁移、侵袭能力增强及EMT相关分子表型改变相关。这些发现将SLC35D1确定为与CRC进展相关的、研究不足的SLC35D家族成员，提示其可能具有预后价值，但其预后价值需在独立临床队列中进一步验证。

**三、主要关键技术方法**

本研究采用多层次的生物信息学与实验方法：利用GENT2和TCGA-COADREAD数据集分析SLC35D家族表达模式，cBioPortal分析遗传改变，Kaplan–Meier Plotter和PrognoScan进行生存分析，DESeq2筛选差异表达基因，基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）和单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）评估通路活性，STRING数据库和CytoNCA插件构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络并筛选枢纽基因，TIMER数据库分析免疫浸润。独立队列验证使用GSE39582（566例原发CRC肿瘤，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片）通过limma和fgsea进行。体外实验使用DLD-1（RRID: CVCL_0248）和HCT116（RRID: CVCL_0291）细胞系（均购自ATCC），采用Neon电穿孔系统转染建立稳定敲降和过表达细胞系，功能实验包括SRB增殖、Transwell迁移/侵袭、集落形成、成球实验，以及RT-qPCR、Western blot、免疫荧光检测EMT和干性标志物。

**四、主要研究结果**

**1. SLC35D家族基因在CRC患者中发生改变**：GENT2数据库分析显示SLC35D1在多种癌症（包括结肠癌、肾癌和肝癌）中显著下调；TCGA-COADREAD数据集分析表明，与正常组织相比，CRC组织中SLC35D1显著下调（p < 0.001），SLC35D3显著上调（p < 0.001），SLC35D2呈不显著降低；分期分析显示SLC35D1在晚期（III/IV期）显著降低，SLC35D3显著升高。

**2. SLC35D家族在CRC患者中的遗传改变**：cBioPortal分析显示SLC35D1突变率为1.4%（主要为错义和截短突变），SLC35D2为1.8%（含扩增），SLC35D3为0.9%；SLC35D1截短变异为p.Gly14Ter无义突变；性别间改变频率无显著差异；SLC35D家族成员间表达无显著相关。

**3. SLC35D家族基因在CRC患者中的临床影响**：Kaplan-Meier分析显示TCGA-COADREAD队列（p = 0.029）和Kaplan-Meier Plotter数据集（p = 0.0023）中SLC35D1低表达与较短总体生存期相关；多因素Cox回归分析证实SLC35D1表达与总体生存期显著独立相关（HR = 0.743, p = 0.021）。

**4. SLC35D1表达与CRC临床病理特征相关**：低SLC35D1表达与晚期疾病分期（III/IV期，p = 0.019）、淋巴结转移（N1/N2期，p = 0.015）和淋巴管浸润（p = 0.001）显著相关。

**5. SLC35D1表达降低与CRC中EMT相关转录程序相关**：GSEA分析显示SLC35D1低表达组显著富集Kras Signaling Dn、Coagulation、Complement、EMT、IL6/JAK/STAT3 Signaling等通路；GSE39582独立队列验证支持EMT和炎症/凝血程序富集的关联可重复；GSVA分析显示SLC35D1表达与EMT通路评分呈显著负相关（相关系数 = -0.111, p = 1.78 × 10^-2）；通过STRING和CytoNCA鉴定出26个枢纽基因。

**6. SLC35D1表达与EMT标志物变化及细胞增殖、迁移和侵袭改变相关**：SLC35D1敲降显著增强细胞增殖、迁移和侵袭能力，过表达则相反；敲降上调间充质标志物（包括N-cadherin、vimentin、fibronectin、ZEB1、SNAIL、MMP1、MMP9、MMP13和FLT1）并降低E-cadherin膜定位；过表达增加E-cadherin mRNA水平并下调间充质标志物；Western blot在蛋白水平验证了上述变化。

**7. SLC35D1敲降与CRC细胞干性相关表型增加相关**：SLC35D1敲降显著增加集落和球体的大小及数量，并上调干性相关基因CD44、STAT3、LGR5、OCT4、C-MYC和SOX2。

**8. SLC35D1表达与CRC中免疫浸润的计算机模拟关联**：TIMER分析显示SLC35D1表达与B细胞、CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润呈正相关；SLC35D1表达与免疫检查点标志物PDCD1、LAG3和HAVCR2呈负相关。

**五、讨论与结论总结**

讨论部分指出，SLC35D家族成员在CRC中呈现不同的表达模式，反映了同一基因家族成员在癌症中的功能异质性，可能涉及差异性的转录调控和表观遗传修饰，以及各成员在底物偏好、亚细胞定位和生物学功能上的差异。SLC35D1在TCGA队列中显示出与临床结局最一致的关联，但独立队列GSE39582未重现其生存关联，提示其预后价值可能存在队列依赖性，需要进一步验证。SLC35D1作为核苷酸糖转运体参与硫酸软骨素生物合成，GAG组成改变和ECM重塑可能构成其与EMT相关表型联系的一种可能的生物学基础，但实验证据仍需进一步探究。肿瘤免疫微环境分析揭示了SLC35D1表达与免疫浸润和免疫检查点标志物的相关性，但这些关联完全基于计算相关，不能证明直接调控关系。研究人员承认研究存在局限性：功能证据主要源于生物信息学和体外实验，缺乏动物模型和临床标本验证；免疫相关关系未经实验检验；SLC35D1的临床实用性和治疗相关性需独立验证；其与EMT和炎症相关转录程序关联的分子机制尚未明确。结论部分总结：本研究确定了SLC35D家族成员在CRC中的不同表达模式，表明较低的SLC35D1表达与不良临床病理特征和TCGA队列中较差的临床结局相关；功能富集分析揭示了SLC35D1表达降低与EMT相关转录特征之间的关联；功能缺失和获得实验表明SLC35D1表达与CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT相关分子表型相关；SLC35D1表达还与免疫细胞浸润和免疫检查点标志物相关。综上，这些发现将SLC35D1确定为与CRC进展相关的一个研究不足的因子，提示其具有潜在的预后意义，但其预后价值需在独立临床队列中进一步验证，其生物学和潜在治疗相关性需要进一步的机制和体内研究。