2-(噻吩-2-基甲基)喹唑啉-4(3H)-酮衍生物抗热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的体外活性与细胞毒性评价

《Pharmaceuticals》：In Vitro Antileishmanial Activity and Cytotoxicity Evaluation of 2-(Thiophen-2-ylmethyl)quinazolin-4(3H)-one Derivatives Against Leishmania tropica and Leishmania infantum

　　

背景/目的：利什曼病是一种被忽视的热带疾病，现有疗法的毒性、疗效有限以及新出现的耐药性凸显了开发新型抗利什曼药物的迫切需求。本研究旨在实验评估喹唑啉-4(3H)-酮衍生物对热带利什曼原虫（Leishmania tropica）和婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）的体外抗利什曼活性、细胞毒性和选择性，并通过计算方法研究化合物E9与锥虫硫酮还原酶（trypanothione reductase, TR）的潜在相互作用。方法：研究人员评估了16种喹唑啉-4(3H)-酮衍生物（E1–E16）对热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫前鞭毛体形式的体外抗利什曼活性。此外，对活性最强的化合物在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的细胞毒性进行了评估，并随后计算其选择性指数（selectivity index, SI）。针对化合物E9与婴儿利什曼原虫锥虫硫酮还原酶进行了分子对接和分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）分析。结果：化合物E2、E9和E11对热带利什曼原虫表现出活性，半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）值分别为23.2、22.4和76.0 μM。相比之下，化合物E2、E3、E9和E11对婴儿利什曼原虫具有活性，IC₅₀值分别为38.1、69.7、28.2和86.7 μM，这表明活性具有物种依赖性。此外，在所测试的化合物中，E2对热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫表现出最优的选择性特征，SI值分别为8.8和5.4。分子对接结果显示E9的对接分数为?8.070 kcal/mol，MM/GBSA分析表明其结合自由能为?82.44 kcal/mol。结论：这些发现支持进一步研究喹唑啉-4(3H)-酮衍生物作为潜在抗利什曼药物，其中E2成为最具选择性的化合物。此外，结果还表明该系列化合物的生物活性可能因利什曼原虫物种而异。分子建模结果提示E9与锥虫硫酮还原酶之间存在潜在相互作用，支持进一步在细胞内无鞭毛体模型和后续体内研究中评价这些化合物的必要性。

论文解读：2-(噻吩-2-基甲基)喹唑啉-4(3H)-酮衍生物抗利什曼原虫的体外活性、选择性及分子机制研究

利什曼病是由利什曼原虫属（Leishmania）原生动物寄生虫引起的被忽视热带病，主要通过媒介昆虫传播，全球超过10亿人生活在流行区，每年估计新增超过100万例皮肤利什曼病（CL）和约3万例内脏利什曼病（VL）。当前临床治疗主要依赖五价锑剂、两性霉素B（含脂质体制剂）和米替福新，但这些药物存在严重副作用、耐药性出现、价格昂贵或疗程长等局限。在该背景下，喹唑啉酮类杂环化合物因其多样的生物活性而受到关注。研究人员此前发现2-(噻吩-2-基甲基)喹唑啉-4(3H)-酮席夫碱衍生物对大型利什曼原虫和杜氏利什曼原虫前鞭毛体具有良好体外活性，但尚未在热带利什曼原虫（土耳其CL的主要病原体）和婴儿利什曼原虫（土耳其VL的主要病原体）中进行系统评价。因此，本研究旨在评估16种该类衍生物（E1–E16）对这两种临床相关虫种的体外抗利什曼活性、细胞毒性及选择性，并通过分子对接等方法探索活性最强化合物的潜在分子靶点。

研究人员采用实验与计算相结合的工作流程。在实验部分，使用CVDK-8试剂盒测定化合物对两种利什曼原虫前鞭毛体的半数抑制浓度（IC₅₀），以米替福新为参照药；对活性达标化合物（IC₅₀<100 μM）进一步在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中测定细胞毒性并计算选择性指数（SI）。在计算部分，针对婴儿利什曼原虫锥虫硫酮还原酶（TR；PDB ID: 2JK6）进行诱导契合分子对接、50 ns分子动力学（MD）模拟及基于轨迹的MM/GBSA结合自由能计算，并以共晶配体黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）重对接进行方法验证。研究使用的虫株为热带利什曼原虫（MHOM/AZ/1974/SAF-K27）和婴儿利什曼原虫（MHOM/TN/1980/IPT1），均来自马尼萨杰拉勒巴亚尔大学医学院寄生虫学系寄生虫库。

研究结果分四部分。第一，体外抗利什曼活性和细胞毒性：化合物E2、E9和E11对热带利什曼原虫显示活性，IC₅₀值分别为23.2、22.4和76.0 μM，其中E2和E9活性与米替福新（21.8 μM）相当；对婴儿利什曼原虫，E2、E3、E9和E11显示活性，IC₅₀值分别为38.1、69.7、28.2和86.7 μM，其中E2和E9接近米替福新（33.8 μM）。HUVEC细胞毒性测试显示E2的IC₅₀为205.3 μM，远低于参照药米替福新的7.6 μM。选择性指数计算表明，E2对热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫的SI分别为8.8和5.4，均显著高于其他化合物及米替福新（0.3和0.2），而E9因宿主细胞毒性较高导致SI较低（0.8和0.6）。第二，分子对接分析：对两种虫种中活性最强的E9进行TR对接，得到对接分数?8.070 kcal/mol，MM/GBSA结合自由能?82.44 kcal/mol；预测E9的喹唑啉酮羰基氧与Lys60形成氢键（1.83 ?），吗啉氧与Gln439形成氢键（2.31 ?），喹唑啉酮核心和噻吩环分别与Arg287胍基形成阳离子–π相互作用（距离4.59和3.87 ?）；重对接验证得到的FAD构象RMSD为0.9427 ?，低于2.0 ?标准，验证了对接方案的可靠性。第三，分子动力学模拟：50 ns MD模拟显示，E9与Lys60的氢键保持率达99%，与Gln439的氢键保持率为39%，吗啉氧还与水分子介导的Ala363形成氢键；蛋白Cα RMSD平均值1.75 ?，配体RMSD约2.0 ?，复合物整体漂移约0.4 ?，蛋白和配体RMSF均约0.8 ?，表明复合物构象稳定，主要相互作用在模拟中得以维持。第四，MD后MM/GBSA分析：从轨迹中提取21个代表帧（间隔2.5 ns），计算得到ΔG_bind范围?88.10至?66.57 kcal/mol，平均值?78.52±4.29 kcal/mol，与初始对接姿态的?82.44 kcal/mol一致，表明复合物在模拟采样构象中保持有利的 energetics。

讨论部分指出，与先前针对大型利什曼原虫和杜氏利什曼原虫的研究相比，本研究发现同一系列化合物在不同利什曼原虫物种间显示出显著差异：E3仅对婴儿利什曼原虫有活性而对热带利什曼原虫无活性，表明物种依赖性生物反应。这种差异可能与不同利什曼原虫物种间膜脂组成、表面糖缀合物（特别是脂磷聚糖）和膜流动性等固有生物学差异有关，也可能涉及药物摄取、细胞内积累和外排等代谢过程。E2对两种虫种的活性与米替福新相当，但其对HUVEC的细胞毒性远低于米替福新，因此SI更高。米替福新在两种虫种上的低SI与其已知的细胞毒性和不良反应一致。分子对接和MD模拟提示E9可能与TR存在潜在相互作用，但计算证据不能确证TR是E9的分子靶点，需要直接的TR抑制实验进行靶点验证。结论部分总结：该系列衍生物对热带利什曼原虫和婴儿利什曼原虫表现出物种依赖性体外活性；在细胞毒性测试的化合物中，E2具有最优选择性，E9对两种虫种具有最强抗寄生虫效力；计算分析提示E9与婴儿利什曼原虫TR存在潜在有利相互作用，但这些发现属于假说生成性质，不能确立TR为E9的分子靶点；未来需在细胞内无鞭毛体模型、直接靶点验证和体内实验中进一步阐明其生物学相关性和治疗潜力。