TH1177、Clemastine及二苯甲基衍生物作为ORAI通道的新型胞外阻断剂

《Biomolecules》：TH1177, Clemastine, and Benzhydryl Derivatives Act as Novel Extracellular Blockers of ORAI Channels

　　

ORAI通道是钙池操纵性钙通道（store-operated Ca²⁺ channels），在生理和病理生理过程中发挥重要作用。ORAI通道调节剂有助于开发药理学干预措施。本研究旨在研究二苯甲基衍生物类似物作为新型ORAI通道阻断剂。研究人员在过表达各ORAI亚型和STIM1的HEK-293细胞中研究了二苯甲基衍生物类似物TH1177、Clemastine、Cloperastine和Diphenhydramine的作用。通过膜片钳记录ORAI电流，并使用荧光钙染料测量胞质Ca²⁺。TH1177抑制ORAI1、ORAI2和ORAI3电流，其半数抑制浓度（IC₅₀）分别为18.3 μM、4.8 μM和35.6 μM。Clemastine抑制ORAI1和ORAI2，但对ORAI3无作用。不含吡咯烷环结构的Cloperastine和Diphenhydramine仅对ORAI1表现出轻微抑制。TH1177的胞内应用及外向式膜片钳（outside-out patch）实验表明，TH1177通过细胞外表面阻断ORAI3电流。TH1177不影响胞质STIM1的聚集和移动。此外，TH1177强效抑制细胞增殖，对HAEC、EA.hy926和HK-2细胞的IC₅₀分别为2.6 μM、5.2 μM和29.4 μM，并诱导凋亡性细胞死亡。结论认为，TH1177是ORAI1-3通道的泛抑制剂，而Clemastine抑制ORAI1和ORAI2但对ORAI3作用甚微。化合物TH1177和Clemastine中的吡咯烷环结构对其抑制活性至关重要。不含吡咯烷环的两种二苯甲基衍生物（Cloperastine和Diphenhydramine）仅对ORAI1有轻微抑制。该研究结果为ORAI通道提供了新的药理学特征。

ORAI通道是钙池操纵性钙通道（store-operated Ca²⁺ channels）的关键分子，在免疫应答、血管功能、肾脏与胰腺生理中发挥重要作用，其异常与免疫缺陷、血栓形成、糖尿病肾病、慢性胰腺炎及肿瘤等病理过程密切相关。目前已知的ORAI通道抑制剂种类有限，且缺乏亚型特异性调节剂，这限制了对ORAI各亚型生物学功能和药物开发的深入研究。因此，研究人员旨在通过筛选结构相关的二苯甲基衍生物，寻找新型ORAI通道阻断剂并明确其亚型选择性和作用机制。

研究人员在稳定共表达荧光标记ORAI1-3与STIM1-EYFP的HEK-293 T-REx细胞模型中，运用全细胞膜片钳和outside-out膜片钳技术记录ORAI电流，结合Fura-PE3/AM钙成像检测胞质Ca²⁺，并采用荧光显微成像观察STIM1聚集和移位，同时通过WST-1增殖实验、LDH细胞毒性实验和流式细胞术评估细胞生长与细胞周期变化。研究发现：TH1177可浓度依赖性抑制ORAI1、ORAI2和ORAI3电流，IC₅₀分别为18.3 μM、4.8 μM和35.6 μM，其中ORAI2最敏感；Clemastine选择性抑制ORAI1和ORAI2，对ORAI3无明显作用；而缺乏吡咯烷环的Cloperastine和Diphenhydramine仅对ORAI1有微弱抑制。进一步实验证明，TH1177通过细胞外表位阻断ORAI3，且不影响STIM1的胞内聚集和移位。在功能层面，TH1177可抑制血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的增殖并诱导凋亡，其作用与阻滞ORAI通道相关。这些结果首次阐明了TH1177和Clemastine作为ORAI通道阻断剂的药理学特征，为开发抗增殖药物和Clemastine的免疫调节作用重定位提供了重要依据。

主要技术方法如下：研究人员利用HEK-293 T-REx细胞四环素诱导表达mCherry/mCFP标记的ORAI1-3及STIM1-EYFP；采用全细胞膜片钳和outside-out膜片钳记录ORAI离子电流；使用Fura-PE3/AM荧光探针测量胞质Ca²⁺浓度；通过荧光显微镜观察STIM1-EYFP聚集分布；以WST-1法检测细胞增殖，LDH释放法检测细胞毒性；采用碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术分析细胞周期和凋亡。样本来源：人主动脉内皮细胞（HAEC）购自PromoCell；EA.hy926内皮细胞系来自ATCC；人近端肾小管上皮细胞系HK-2来自LGC Standards；永生化人足细胞由布里斯托大学Prof. M. Saleen提供。

研究结果如下：

3.1 二苯甲基衍生物TH1177、Clemastine、Cloperastine和Diphenhydramine对ORAI通道的作用
利用全细胞膜片钳在共表达ORAI1-3与STIM1-EYFP的HEK-293 T-REx细胞中记录电流，发现TH1177以浓度依赖性方式抑制ORAI1、ORAI2和ORAI3电流，对ORAI2的抑制效力最高。Clemastine可抑制ORAI1和ORAI2，但对ORAI3无明显作用；Cloperastine和Diphenhydramine仅对ORAI1产生轻微抑制，而对ORAI2和ORAI3无效，表明吡咯烷环结构是ORAI通道抑制活性的关键基团。

3.2 TH1177对ORAI通道的胞外抑制
将TH1177加入移液管内液进行胞内应用，并不能阻断2-APB激活的ORAI3电流；但在outside-out膜片钳记录中，细胞外施加10 μM TH1177可显著抑制ORAI3电流，且该抑制作用在冲洗后可逆，证明TH1177通过作用于通道的细胞外表位而阻断ORAI3。

3.3 TH1177对胞质STIM1运动的影响
在稳定表达STIM1-EYFP的细胞中，TG诱导STIM1向质膜下聚集形成puncta；TH1177预处理并不改变STIM1的聚集和向质膜移位，说明TH1177不干扰STIM1的动线，而是直接作用于ORAI通道蛋白。

3.4 TH1177对Ca²⁺释放和SOCE的影响
在EA.hy926、HK-2及过表达ORAI的HEK-293细胞中，TH1177仅在较高浓度（≥50 μM）时抑制内质网Ca²⁺释放；而ORAI1介导的SOCE在低浓度下即被抑制，IC₅₀约为4.57 μM；ORAI2和ORAI3介导的SOCE则需要更高浓度的TH1177。siRNA敲低ORAI1不影响Ca²⁺释放，表明高浓度TH1177对ER Ca²⁺释放的抑制属于非特异性效应。

3.5 TH1177对细胞生长和死亡的影响
WST-1实验显示TH1177可抑制HAEC、EA.hy926和HK-2细胞增殖，IC₅₀分别为2.6 μM、5.2 μM和29.4 μM；与已知ORAI泛抑制剂BTP2相比，两者在HK-2和足细胞中的抗增殖效力相近。LDH实验表明，TH1177浓度高于50 μM时引起明显细胞死亡。流式细胞术结果显示，低浓度TH1177（1–5 μM）增加G0/G1期细胞比例，而高浓度（25 μM）诱导凋亡并减少S期和G2/M期细胞，说明TH1177通过阻滞细胞周期G1/S和G2/M转变来抑制细胞生长。

讨论总结：本研究将ORAI通道确认为TH1177的新药理学靶点，并揭示了TH1177对ORAI2亚型具有相对更高的敏感性，同时证明其阻断作用发生在细胞外表位。与多种T型钙通道阻滞剂相比，TH1177对ORAI的抑制作用具有结构特异性。Clemastine对ORAI1和ORAI2的抑制活性可能部分解释其免疫调节作用，为其作为ORAI相关疾病的免疫调节剂进行重定位提供了方向。高浓度TH1177的脱靶效应提示其临床应用需谨慎评估，未来需通过内源基因编辑模型及动物实验进一步验证其治疗潜力。

研究结论可概括为：TH1177是ORAI1-3的泛抑制剂，但对ORAI2的作用更强；Clemastine则特异性抑制ORAI1和ORAI2。TH1177的作用位点位于细胞外，这为后续化合物筛选和潜在的抗增殖药物开发提供了新线索；Clemastine全新的药理学特征有望促进其通过抑制ORAI通道而作为免疫调节剂被重新评估。