纹状体多巴胺替代基因治疗帕金森病：生化基础与当前临床经验

《Expert Opinion on Biological Therapy》：Dopamine-replacing gene therapy for Parkinson’s disease: biochemical background and current clinical experience

　　

摘要 引言：帕金森病（Parkinson's disease, PD）的核心运动症状源于纹状体中多巴胺的严重耗竭。左旋-3,4-二羟基苯丙氨酸（l-DOPA）仍是PD的金标准治疗方法。然而，由于芳香族L-氨基酸脱羧酶（aromatic l-amino acid decarboxylase, AADC）活性降低以及多巴胺储存能力的进行性丧失，治疗疗效逐渐下降。因此，旨在恢复纹状体内局部多巴胺生成的基因治疗已成为一种有前景的治疗策略。 涵盖领域：本综述总结了纹状体中多巴胺的代谢、生理功能及病理生理学，并讨论了将多巴胺合成酶基因转移至纹状体的临床研究。 专家观点：开放标签的早期阶段研究已显示，PD患者在接受腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体介导的AADC基因递送后出现临床改善的信号。评估酪氨酸羟化酶、三磷酸鸟苷环化水解酶I及AADC联合递送的临床研究正在进行中。初步结果有待在更大规模的随机对照试验中进一步验证。由于多巴胺是在被转导的中等多棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）中合成，而非在黑质纹状体多巴胺能末梢中合成，生理性多巴胺信号传导无法完全恢复。尽管如此，持续的局部多巴胺产生预计将提供持久的症状改善。与细胞移植相比，基因治疗具有重要优势，包括无需免疫抑制治疗以及较低的生产成本。 关键词：多巴胺；酪氨酸羟化酶；芳香族L-氨基酸脱羧酶；三磷酸鸟苷环化水解酶I；腺相关病毒

论文主体内容总结

1. 引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经退行性疾病，随着人口老龄化，其全球患病率持续增加。多数PD病例为散发性，仅5-10%为家族性。目前已鉴定出超过10个致病基因，包括SNCA、LRRK2、VPS35、PRKN、PINK1、PARK7、VPS13C、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7、DNAJC6、SYNJ1、CHCHD2等，以及GBA1变异等遗传风险因素。PD的病理学标志是黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNc）多巴胺能神经元的进行性变性，导致纹状体中多巴胺显著耗竭，进而引起运动迟缓、僵硬和静止性震颤等核心运动表现。口服左旋多巴（l-DOPA）仍是症状治疗的基础，其通过芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）转化为多巴胺。然而，随着黑质纹状体投射的退化，AADC活性下降，l-DOPA疗效减弱，同时突触囊泡数量减少进一步降低多巴胺储存能力。

疾病早期，单次口服l-DOPA可维持约4-5小时的良好运动状态（ON期）。发病数年后，药效持续时间缩短（剂末现象），晚期PD还可出现延迟ON或ON-OFF间突然波动。连续肠内或皮下输注l-DOPA可用于减少波动，但即使高剂量外周给药也未必能持续改善运动症状。脑深部电刺激（deep brain stimulation, DBS）可改善运动功能并控制l-DOPA诱导的异动症，但刺激相关不良反应日益受到关注。因此，细胞移植和基因治疗成为多年来的研究重点。

2. 纹状体中多巴胺的代谢与调控

2.1. 多巴胺的生物合成途径

多巴胺由酪氨酸经酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）和AADC两步酶促反应合成。TH催化酪氨酸转化为l-DOPA，其活性需要亚铁离子、分子氧和辅因子l-赤式-5,6,7,8-四氢生物蝶呤（BH₄）。BH₄由三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate, GTP）经三种酶合成：GTP环化水解酶I（GCH）、丙酮酰四氢蝶呤合酶（PTPS）和墨蝶呤还原酶（SPR）。GCH催化第一步且为限速步骤，其由10个相同亚基组成，催化中心含锌。GCH在需要BH₄作为辅因子的细胞中高表达。BH₄在纹状体中尤为丰富，定位于黑质纹状体多巴胺能末梢。

2.2. 多巴胺生物合成的调控

TH是多巴胺生物合成的限速酶，其活性受多因素严格调控。

2.2.1. Th基因的转录调控

Nurr1（NR4a2）是发育过程中诱导Th基因表达及维持成体脑中TH表达的关键转录因子，调控包括Th、AADC、多巴胺转运体（DAT, Slc6a3）和囊泡单胺转运体（VMAT2）在内的多种多巴胺能基因表达。Nurr1还与其他中脑多巴胺能神经元发育相关转录因子（如Pitx3、Lmx1a/b、En1/En2）协同作用。Th基因5‘-启动子区域附近存在AP-1和cAMP反应元件（CRE）顺式作用元件。神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）可增强Th表达。

2.2.2. 磷酸化与终产物的反馈抑制

TH蛋白由N端调控结构域（第1-164位氨基酸）、催化结构域（165-460）和四聚化结构域（461-497）组成。人TH N端调控区多个丝氨酸残基（第19、31、40位）可被磷酸化，其中Ser40由cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）磷酸化。Ser40磷酸化通过释放活性位点铁离子结合的多巴胺增强TH活性。儿茶酚胺（多巴胺或去甲肾上腺素）通过其酚环上两个羟基与活性位点铁离子的螯合结合使酶失活，这是TH活性的主要短期调控机制。Ser40磷酸化通过N端调控区的构象变化释放结合的儿茶酚胺，在生理pH（约7.2）下恢复TH活性。这种短期调控被认为可保护多巴胺产生细胞免受胞内多巴胺积累引起的氧化应激。近期一项多中心I期试验采用了缺失90个氨基酸N端调控结构域的截短TH变体（TH_Δ90），以绕过多巴胺介导的负反馈并最大化l-DOPA合成。

2.2.3. 蛋白稳定性

Ser40磷酸化的TH不稳定，体外研究显示其热不稳定性和蛋白酶敏感性增加，而多巴胺结合的失活TH则稳定。N端调控区被认为是一种内在无序区域。BH₄缺乏可导致脑内TH蛋白量下降，尤其在神经末梢。携带TH_S40E突变（模拟Ser40磷酸化）的小鼠中脑TH活性升高，但纹状体TH蛋白水平降低，提示该突变体不稳定且易被降解，或构象改变导致轴突运输障碍。

2.3. 多巴胺在纹状体中的作用

纹状体是基底节的输入核团，接收大脑皮层的感觉信息。约95%的纹状体神经元为抑制性中等多棘神经元（MSNs），以γ-氨基丁酸（GABA）为神经递质。单胺能神经元不仅通过布线传递（wiring transmission）还通过容积传递（volume transmission）传递信号。纹状体MSNs根据多巴胺受体表达和投射靶标分为两类：表达D1受体并直接投射至苍白球内侧部（GPi）和黑质网状部的“直接通路”，以及表达D2受体并投射至苍白球外侧部（GPe）的“间接通路”。D1受体偶联G_olf蛋白，激活腺苷酸环化酶并增强cAMP/PKA通路；D2受体偶联G_i蛋白，抑制腺苷酸环化酶。D1受体对多巴胺的亲和力较低（K_d ~1 μM），而D2受体亲和力较高（K_d ~25 nM）。短暂的多巴胺爆发性释放被认为激活D1受体，而持续的紧张性多巴胺释放激活D2受体。当细胞外多巴胺水平降低导致D2受体不再被激活时，可出现僵硬和运动不能等帕金森症状。

2.4. 多巴胺代谢遗传缺陷所致疾病

BH₄是TH的必需辅因子。GCH缺乏和PTPS缺乏患者因苯丙氨酸羟化酶（PAH）反应受扰而出现高苯丙氨酸血症，同时伴有多巴胺和血清素缺乏。SPR缺乏患者血苯丙氨酸水平正常，可能因醛酮还原酶（AKR）超家族中多种同工酶可替代SPR活性。常染色体显性GCH突变导致多巴反应性肌张力障碍（DYT5a，Segawa病），因GCH是BH₄合成的限速酶，GCH活性降低超过50%会显著损害纹状体BH₄的可用性，表明黑质纹状体多巴胺能神经元对BH₄可用性高度敏感。

3. 帕金森病的基因治疗

目前已进入临床评估的PD基因治疗策略包括：（1）向壳核递送多巴胺生物合成关键酶基因以恢复局部多巴胺产生；（2）向壳核和SNc递送神经营养因子基因以保护黑质纹状体通路；（3）在丘脑底核产生GABA以调节基底节活动；（4）增强携带GBA1突变个体的葡萄糖脑苷脂酶（GBA）活性以减缓神经退行。此外，大量基因治疗策略仍处于临床前开发阶段，包括针对功能缺失性疾病的基因补充或基因替代，以及针对功能获得性机制的miRNA、shRNA介导的致病基因表达抑制和靶向α-突触核蛋白的单链可变区片段（scFvs）递送。

3.1. 病毒载体

目前PD基因治疗临床试验中使用的病毒载体主要基于AAV和慢病毒平台。重组AAV载体源自非致病性野生型AAV，免疫原性显著低于腺病毒或疱疹病毒载体。转导后载体基因组主要以游离体形式存在于核内，极少整合至宿主基因组，因此在分裂细胞中转基因表达会被稀释，但在神经元等有丝分裂后细胞中可维持多年。灵长类壳核中转基因表达可持续超过15年。AAV2是脑内PD试验中研究最充分的血清型，其包装容量约4.5 kb，可通过共施用多个AAV载体实现同一神经元内不同治疗基因的同步表达。脑内治疗PD所用载体剂量比全身给药低约两个数量级，安全性良好。成人中AAV中和抗体常见，但预先存在的抗体对直接实质内给药后的转导效率影响甚微。PD临床研究中使用的慢病毒载体源自马传染性贫血病毒（EIAV），其主要优势是包装容量约9 kb，可递送更大或多个治疗性表达盒。

3.2. AADC基因转移

AADC基因转移的临床研究旨在恢复晚期PD患者壳核内l-DOPA向多巴胺的转化。在一项初始临床研究中，6名患者双侧壳核输注3×10¹¹ vg表达AADC的AAV载体，6个月后统一帕金森病评定量表（UPDRS）运动评分改善46%，[¹⁸F]氟-l-间酪氨酸（FMT）PET显示壳核摄取增加56%。另一项10名患者的研究中，低剂量组接受9×10¹⁰ vg，高剂量组接受3×10¹¹ vg，6个月后UPDRS运动评分平均改善36%，FMT摄取在低剂量组增加30%、高剂量组增加75%，PET信号持续长达4年。研究者认为总体PET信号强度仍相对较低，AADC表达仅限于壳核不足25%的区域，需更高载体剂量以扩大壳核覆盖范围。一项Phase Ib开放标签剂量递增试验中，AAV-AADC载体剂量高达4.7×10¹² vg（1.8 mL），12个月时UPDRS运动评分改善12-17分，最高两个剂量队列在36个月时抗帕金森药物需求减少21%-30%。该研究因部分参与者出现MRI异常而被FDA临床暂停。在AADC缺乏症中，AAV2-AADC（eladocagene exuparvovec）已在多国获批，早期治疗与更好的临床结局相关。

3.3. TH、GCH和AADC的基因转移

持续多巴胺能刺激被认为是减少晚期PD患者运动波动的关键策略。一种方法采用基于EIAV的慢病毒载体同时递送TH、GCH和AADC基因至壳核，但初始Phase I/II临床试验未显示明确临床疗效，后续试验因申办方破产而提前终止。使用AAV平台的替代性多载体策略正在积极推进。日本（jRCT2033250070）和泰国（COA-CREC113/2025）的临床试验评估了分别编码TH、GCH和AADC的三种AAV载体以1:1:1比例混合的递送方案。临床前研究表明，该三AAV鸡尾酒共输注可转导>90%的纹状体靶细胞并同时表达三种必需酶，恢复内源性调控的多巴胺合成。近期中国研究者报告了一项双中心、开放标签、剂量递增的Phase I试验，纳入10例中晚期PD患者，评估共表达AADC和修饰TH基因的AAV载体。该TH变体（TH_del90）缺失90个氨基酸的N端调控结构域，可在多巴胺产生的情况下维持TH活性。高剂量队列（1.2×10¹² vg）在12个月内出现显著运动改善，Off状态MDS-UPDRS第三部分评分平均下降21.6分（46%），ON时间（无麻烦性异动症）显著增加3.3小时。低剂量队列（4.0×10¹¹-1.0×10¹² vg）在头12个月运动反应异质性较大。

4. 细胞移植

细胞移植是另一种恢复纹状体多巴胺能功能的策略。近期报告了使用诱导多能干细胞（iPS细胞）来源和胚胎干细胞（ES细胞）来源多巴胺能神经元的临床研究结果。细胞移植和基因治疗共同的优势是单次干预后可在壳核提供长期多巴胺能替代，但这也意味着出现严重不良事件时治疗不易终止。两种方法均不能有效解决对多巴胺能替代治疗仅部分响应或不响应的症状，包括姿势不稳、冻结步态、认知障碍、躯干前屈、情感淡漠和疼痛。细胞移植还有额外局限：移植细胞可能最终出现路易体病理，异体移植通常需要免疫抑制治疗。为克服此局限，正在通过基因组编辑开发免疫原性降低的通用供体细胞。

5. 专家意见

PD现被认识为多系统神经退行性疾病，其病理基础比传统概念中黑质纹状体多巴胺能通路选择性变性的认识更广泛和复杂。运动症状（尤其是运动不能和僵硬）仍是残疾的主要决定因素，主要源于壳核多巴胺缺乏，因此恢复该区域多巴胺产生的基因治疗是最直接的治疗方法之一。AAV载体介导的AADC基因递送联合口服l-DOPA的临床试验已显示出有前景的运动功能改善，但现有证据主要来自样本量较小、随访期有限的队列。与AADC缺乏症不同，PD不仅存在AADC活性降低，还存在TH和GCH活性受损，因此正在开发同时递送这三种基因至壳核的策略。由于PD中SNc来源的轴突末梢已丧失，多巴胺无法储存于突触囊泡，推测不会发生时相性分泌。早期使用慢病毒载体的三基因联合临床研究未显示显著临床获益，很可能因转基因表达不足。使用AAV载体的临床试验正在进行中。将该基因治疗引入临床实践需开展下一阶段临床试验（理想情况下包括假手术对照），分析参与者背景、症状严重程度和用药史等因素以确定最适适应证，并进一步研究AAV载体的衣壳、启动子、转基因、剂量和给药方法以确定最佳治疗参数。此外，需考察与DBS在适应证和长期预后方面的差异。