《Molecules》：Development of an LC–MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Erythromycin A and Seven Metabolites: Initial Residue Profile in Salmon Muscle with Skin
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研究人员开发并验证了一种稳健的液相色谱-串联质谱法，用于测定三文鱼肌肉带皮组织中的红霉素A及其代谢物：红霉素B、红霉素C、红霉素A N-氧化物、脱水红霉素A、N-去甲基红霉素A、红霉素A烯醇醚和假红霉素A烯醇醚。组织样品加入红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素
研究人员开发并验证了一种稳健的液相色谱-串联质谱法，用于测定三文鱼肌肉带皮组织中的红霉素A及其代谢物：红霉素B、红霉素C、红霉素A N-氧化物、脱水红霉素A、N-去甲基红霉素A、红霉素A烯醇醚和假红霉素A烯醇醚。组织样品加入红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素A N-氧化物、红霉素A烯醇醚和假红霉素A烯醇醚至50–200 ng/g，以及脱水红霉素A和N-去甲基红霉素A至500–2000 ng/g，并使用替代内标，经乙腈提取、正己烷脱脂和水稀释后，准确度为87%至108%，精密度为3%至13%，估计定量限为0.02至1.2 ng/g。给药后3天的受试三文鱼样品显示红霉素A为主要残留物，而在第28天，N-去甲基红霉素A和脱水红霉素A作为潜在标志物超过500 ng/g水平。
论文解读文章
研究背景与目的
在水产养殖业中，抗生素被广泛用于控制养殖水生动物的细菌感染。然而，尤其是在监管有限的发展中国家，食用鱼类中抗生素的滥用问题日益受到关注。养殖户可能使用未经批准的化合物或不遵守休药期，导致鱼体组织中残留过量的抗生素。摄入含有过量抗生素残留的鱼肉会增加抗菌素耐药性的健康风险。为了减轻人类对药物残留的暴露，欧盟、日本和美国等监管机构依据科学数据对食用动物中使用的新兽药进行食品安全评估。这类安全评估研究需要能够全面检测药物及其代谢物谱的化学方法，以便确定标志残留物。标志残留物可以是原药或其代谢物，其浓度与特定可食组织中的总残留水平存在相关性。
对于鲑科鱼类养殖中的重要疾病——细菌性肾病，美国正在研究两种大环内酯类抗生素红霉素制剂的新兽药申请。目前，监管机构采用半定量的微生物学方法来批准和研究红霉素在鲑科鱼类中的使用，该方法基于抗菌活性将红霉素A的耐受量设定为100 ng/g。然而，微生物学方法存在非特异性、劳动强度大和耗时长的缺点。目前尚无关于红霉素在鲑鱼体内总残留和代谢数据的研究，无法提出合适的标志残留物。因此，需要更先进的化学检测方法来监测鲑科食用鱼中的红霉素残留，以确保食品安全和消费者保护。
本研究旨在开发并验证一种LC-MS/MS方法，用于同时测定和鉴定大西洋鲑鱼肌肉带皮组织中的红霉素A及其七种代谢物，以确定红霉素A在鲑鱼体内的代谢谱，并识别潜在的标志残留物用于监测。
关键技术与方法
研究人员采用液相色谱-串联质谱技术进行分析。使用Kinetex Biphenyl uHPLC色谱柱实现分离，流动相为含0.1%甲酸的水和乙腈。质谱检测器为Sciex 6500 QTRAP，在正离子电喷雾电离模式下运行，采用多反应监测模式采集数据。样品前处理包括乙腈液液萃取、正己烷脱脂和纯水稀释。定量分析使用溶剂校准曲线和同位素标记的内标。方法验证遵循FDA指南，评估了选择性、线性、准确度、精密度、基质效应和定量限。受试三文鱼样品来自美国农业部国家冷水海洋水产养殖中心，鱼只通过口服灌胃连续三天给予含红霉素硫氰酸盐的实验性饲料预混料，剂量为100 mg/kg体重。
研究结果
2.1 方法开发与验证
研究人员最初尝试了包含氮气吹干、超声和过滤等步骤的复杂提取方法，结合大气压化学电离质谱分析，但实验室结果不可重现。随后简化了提取流程，省略了蒸发、超声和过滤步骤，并改用溶剂校准曲线和电喷雾电离质谱，最终方法准确度在87%至108%之间，精密度在3%至13%之间，估计定量限范围为0.02至1.2 ng/g。色谱分离优化后，使用Phenomenex Kinetex Biphenyl色谱柱获得了对称的峰形和良好的分离度。所有分析物的校准曲线线性良好，相关系数大于0.995。基质效应评估结果显示所有分析物均在±10%以内，表明基质影响不显著。稀释试验表明，在1:8和1:4稀释比例下，红霉素A、N-去甲基红霉素A和脱水红霉素A浓度的变异系数分别在5%-10.5%范围内，验证了方法的可靠性。
2.2 红霉素A在大西洋鲑鱼肌肉中的代谢谱及潜在代谢物
对给药后不同时间点收集的肌肉样品进行分析后发现，原药红霉素A以及代谢物脱水红霉素A和N-去甲基红霉素A是第14天样品中的主要残留物。在第3天的样品中，红霉素A残留占主导地位，随后迅速下降，并在后续时间点降至低于50 ng/g的方法验证下限。脱水红霉素A的残留水平在初期上升后才随时间下降。在给药后第28天的样品中，可食肌肉中脱水红霉素A的水平最高，其次是N-去甲基红霉素A和红霉素A。其他分析物的残留水平相对较低。
结论与意义
研究结果表明，所开发的LC-MS/MS方法简便、有效且灵敏，能够利用市售参考标准对大西洋鲑鱼肌肉带皮组织中的红霉素A及其七种潜在代谢物进行定量分析。使用同位素标记的红霉素A作为内标，确保了方法对所有测试分析物具有高精密度和准确度。红霉素A、N-去甲基红霉素A和脱水红霉素A是给药后不同时间点采集的三文鱼肌肉样品中的主要残留物。代谢谱显示，经过28天的休药期后，脱水红霉素A和N-去甲基红霉素A仍然是主要残留物，这表明这些代谢物可作为监测三文鱼中红霉素残留的潜在标志残留物。
