水飞蓟宾负载ZIF-8纳米复合材料对大肠杆菌的抗菌活性及acrB、recA和htpX基因表达调控研究

《Antibiotics》：Synthesis and Characterization of Silibinin-Loaded ZIF-8 Nanocomposites and Their Antibacterial Activity Against Escherichia coli: Insights into acrB, recA, and htpX Gene Expression

　　

背景/目的： 本研究采用一锅法成功合成了ZIF-8及负载不同浓度水飞蓟宾（silibinin）的ZIF-8纳米结构，并通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDX）对其进行了表征。方法： 研究人员随后通过最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定，评估了所合成纳米结构对大肠杆菌（Escherichia coli）、大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗菌活性。结果： 在所有 tested formulations 中，S2@ZIF-8 对大肠杆菌表现出最强的抗菌活性，MIC 为 32 μg/mL，MBC 为 64 μg/mL。在琼脂孔扩散试验中，S2@ZIF-8 产生的抑菌圈直径为 12.1 ± 0.35 mm。在 MIC 浓度下评估的抗生物膜活性显示，S2@ZIF-8、S1@ZIF-8 和原始 ZIF-8 的抑制率分别为 52.6 ± 0.50%、33.5 ± 0.50% 和 29.9 ± 0.17%。此外，基因表达分析表明，S2@ZIF-8 对 acrB 和 htpX 基因表达具有显著抑制作用，而对 recA 的抑制作用相对中等。结论： 总体而言，在所测试的制剂中，S2@ZIF-8 表现出优异的抗菌和抗生物膜活性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

食源性疾病持续构成全球重大公共卫生挑战，每年导致约8.66亿人次患病和152万人死亡，对公共卫生系统、食品安全和国民经济造成沉重负担。在大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）等主要食源性病原菌中，大肠杆菌被公认为全球食源性感染和食品污染的主要细菌性病原体之一。抗菌药物耐药性大肠杆菌菌株的快速出现和传播进一步削弱了传统抗菌疗法的有效性，给食品安全管理和感染控制带来了重大挑战。此外，大肠杆菌在不利环境条件下存活并在食品接触表面形成持久生物膜的能力，显著增强了其对消毒剂和抗菌药物的耐受性，从而促进了其在食品加工环境中的长期存续和交叉污染。

然而，开发有效的替代抗菌策略需要全面理解食源性大肠杆菌在食品生产链中应对抗菌干预的适应机制。细菌DNA损伤应答、膜蛋白稳态和多重药物外排系统是决定细菌存活和应激适应的关键因素。其中，RecA介导的SOS应答协调DNA修复和同源重组；HtpX参与应激条件下的膜蛋白质量控制；AcrB作为主要的多药外排泵，介导对广谱抗菌药物的耐药性。因此，能够破坏细菌应激反应通路（包括recA、htpX和acrB相关机制）的抗菌策略，不仅可能增强抗菌功效，还能提供超越常规敏感性评估的细菌适应机制见解。

水飞蓟宾（silibinin）作为水飞蓟（Silybum marianum）种子中的主要黄酮木脂素类化合物，因其广谱生物活性和良好的安全性而成为有前景的抗菌候选物。然而，其极差的水溶性、缓慢的溶出速率和由此导致的低生物利用度严重制约了其实际应用。为克服难溶性生物活性化合物的理化局限性，纳米技术药物递送系统应运而生。其中，沸石咪唑酯框架-8（ZIF-8）作为金属有机框架（MOF）家族中锌基成员，凭借其高比表面积、可调孔隙率、高载药能力、理化稳定性和pH响应性药物释放特性，成为极具吸引力的药物递送平台。

尽管水飞蓟宾已被纳入多种纳米载体系统，ZIF-8也作为药物递送平台和抗菌纳米材料被广泛研究，但水飞蓟宾负载ZIF-8对食源性大肠杆菌的抗菌功效及其潜在分子机制尚未得到全面研究。特别是，水飞蓟宾负载ZIF-8能否在抑制细菌生长和生物膜形成的同时，调控与应激反应、生物膜形成和抗菌药物耐药性相关的基因（包括recA、htpX和acrB）表达，这一问题仍不清楚。

二、研究设计与技术方法

研究人员采用一锅合成法制备了原始ZIF-8及负载不同浓度水飞蓟宾的S1@ZIF-8（10 mg水飞蓟宾）和S2@ZIF-8（20 mg水飞蓟宾）纳米复合材料。表征手段包括傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）以及X射线衍射（XRD）。抗菌活性通过刃天青（resazurin）指示的微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），并通过琼脂孔扩散法和结晶紫生物膜试验分别评估抑菌圈和抗生物膜活性。基因表达分析采用实时定量PCR（qRT-PCR），以16S rRNA基因为内参，通过2^?ΔΔCt法计算acrB、recA和htpX的相对表达水平。

三、研究结果

3.1 表征结果

FT-IR分析显示，水飞蓟宾负载后，ZIF-8的C–N伸缩振动带从1161 cm^?1移至1146 cm^?1，表明咪唑配体的局部化学环境发生改变；水飞蓟宾的特征C=O伸缩振动带在S2@ZIF-8中移至1638 cm^?1且更为突出，反映其更高的载药量。Zn–N伸缩振动在420.4 cm^?1保持不变，证实ZIF-8晶体框架在药物负载后得以保留。SEM观察显示，原始ZIF-8呈相对均匀的球形至亚球形形态，粒径约100–180 nm；水飞蓟宾负载后整体形貌得以保持，但表面粗糙度显著增加，出现皱褶和纹理化外观。EDX分析表明，S2@ZIF-8中氧含量从原始ZIF-8的1.71%显著增加至12.59%，与水飞蓟宾分子（C₂₅H₂₂O₁₀）的富氧特性一致。XRD分析显示，S2@ZIF-8保留了ZIF-8框架的主要特征衍射峰，但约2θ ≈ 11°处的反射峰显著减弱，提示水飞蓟宾掺入导致局部结构无序。S1@ZIF-8和S2@ZIF-8的包封效率（EE）分别为77.3 ± 1.2%和80.3 ± 3.1%。

3.2 抗菌活性评估

MIC和MBC测定结果显示，S2@ZIF-8对大肠杆菌表现出最强抗菌活性，MIC为32 μg/mL，而S1@ZIF-8和ZIF-8的MIC均为256 μg/mL。对大肠杆菌O157:H7，S2@ZIF-8的MIC为256 μg/mL，S1@ZIF-8和ZIF-8均为512 μg/mL。对单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌，三种纳米制剂均表现出512 μg/mL的MIC。游离水飞蓟宾对大肠杆菌的MIC为256 μg/mL。琼脂孔扩散试验中，S2@ZIF-8对大肠杆菌产生12.1 ± 0.35 mm的抑菌圈，S1@ZIF-8为11.0 ± 0.28 mm，而原始ZIF-8未观察到抑菌圈，庆大霉素阳性对照为22.0 ± 0.50 mm。

3.3 抗生物膜活性评估

结晶紫生物膜试验表明，所有制剂均以浓度依赖性方式抑制大肠杆菌生物膜形成。在2 × MIC浓度下，S2@ZIF-8、S1@ZIF-8、游离水飞蓟宾和ZIF-8的生物膜抑制率分别为67.2 ± 0.40%、46.1 ± 0.35%、44.7 ± 0.62%和36.1 ± 0.32%。在MIC浓度下，抑制率分别为52.6 ± 0.50%、33.5 ± 0.50%、31.4 ± 0.95%和29.9 ± 0.17%。S2@ZIF-8在所有浓度下均表现出最高的抗生物膜活性。

3.4 基因表达分析

qRT-PCR分析显示，经S2@ZIF-8处理后，大肠杆菌所有目标基因均出现下调。acrB基因下调最为显著，log₂倍变化为?5.234，表达量降至未处理对照水平的约2.66%；htpX基因亦显著下调，log₂倍变化为?2.158，表达量降低约4.46倍；recA基因响应相对温和，log₂倍变化为?0.558，表达量较对照降低约32%。

四、讨论与结论

讨论部分指出，acrB基因编码大肠杆菌AcrAB–TolC外排泵的能量依赖性转运蛋白组分，其下调提示S2@ZIF-8抑制了细菌膜转运和防御系统。recA基因在细菌基因组完整性维持中发挥核心作用，其下调提示细菌SOS应答和DNA修复能力受到抑制。htpX基因参与细胞质膜损伤膜蛋白的去除，其下调表明S2@ZIF-8不仅诱导膜应激，还可能损害细菌的膜蛋白质量控制能力。这些发现与Ag纳米颗粒负载ZIF-8-NH₂体系的研究结果一致，后者同样观察到DNA修复、ROS应答和膜转运相关基因的下调。

研究结论指出，本研究成功合成了ZIF-8和水飞蓟宾负载ZIF-8纳米复合材料，并通过FT-IR、SEM、EDX和XRD分析完成了表征。S2@ZIF-8对大肠杆菌表现出最强的抗菌活性（MIC为32 μg/mL，而原始ZIF-8为256 μg/mL），并展现出显著的抗生物膜活性。基因表达分析显示recA、acrB和htpX均下调，表明S2@ZIF-8的抗菌作用可能涉及对DNA修复、多药耐药和细胞应激相关细菌应答的调控。总体而言，S2@ZIF-8在所测试制剂中表现出优异的抗菌和抗生物膜活性，其效应归因于水飞蓟宾与ZIF-8的协同作用及纳米复合材料的理化特性，为开发针对致病性大肠杆菌的替代抗菌系统提供了有前景的纳米平台。