《Current Biology》：Microbial community dynamics in a traditional Swiss mountain cheese over 142 years of cheesemaking
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摘要
奶酪制造的历史与微生物群落的演化密切相关，其发展历程涵盖了从自发发酵到现代标准化生产的转变。过去一个世纪中快速的技术变革可能对奶酪微生物群落造成了深远影响，然而这一领域至今仍缺乏系统研究。研究人员采用鸟枪法宏基因组学（shotgun metageno
摘要
奶酪制造的历史与微生物群落的演化密切相关，其发展历程涵盖了从自发发酵到现代标准化生产的转变。过去一个世纪中快速的技术变革可能对奶酪微生物群落造成了深远影响，然而这一领域至今仍缺乏系统研究。研究人员采用鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）和16S rRNA扩增子测序技术，以同一高山乳制品厂1875年至2017年间保存的奶酪轮为材料，考察了瑞士传统奶酪Raclette du Valais中微生物群落的演变。结果表明，微生物群落组成的显著差异与生产实践的改变相吻合。最古老的奶酪含有独特的细菌群落，以植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus paraplantarum）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、Pseudolactococcus laudensis及肠道相关类群为主。抗生素抗性基因的消长反映了历史上兽药使用情况；乳酸菌的驯化早于本研究所覆盖的时间段；1875年样本中的噬菌体属已与现代奶酪工厂中的噬菌体群落相当。上述发现凸显了人类实践在时间尺度上对奶酪微生物群落的塑造作用。
论文解读：142年瑞士传统奶酪微生物群落的宏基因组学解密
一、研究背景与科学问题
奶酪制造的历史可追溯至约公元前5200年，如今全球已有超过1000种奶酪品种。然而，过去一个世纪中，受微生物学与技术进步的推动，奶酪生产经历了自其起源以来最为深刻的变革。从微生物学角度，近两个世纪的奶酪制造可划分为三个部分重叠的阶段：约20世纪以前的“自发期”，依赖自发发酵和回灌（back-slopping）；随后的“手工期”，出现了通过原料乳室温 incubation 或回灌制备的天然发酵剂以及商业凝乳酶；以及以商业发酵剂应用为标志的“标准化期”，实现了工业化规模生产，伴随机械化、卫生改善、温度控制以及发酵 produced 凝乳酶对传统犊牛皱胃酶的替代等技术进步。
这些转变对微生物群落的影响可能极为深远。卫生改善与奶酪细菌多样性下降相关联；抗生素的使用改变了乳品质和微生物组成，甚至引发奶酪制造失败，并促进了抗菌药耐药性的传播；接种方式从自发发酵（涉及乳源微生物、乳品厂环境和犊牛凝乳酶）逐步演变为标准化商业发酵剂，可能驱动了细菌群落组成最显著的变化，并对噬菌体种群产生级联效应。然而，评估这些历史转变对奶酪微生物群落的影响长期受困于缺乏覆盖各生产时期的样本。尽管已发现若干古代奶酪遗存，但它们仅是早期乳品实践的孤立快照，无法捕捉上世纪的关键技术发展。
二、研究基础与样本来源
本研究的独特基础在于瑞士瓦莱州阿尔卑斯山谷中一种与转场放牧相关的丧葬传统——“亡者之宴”。在该习俗中，一块在特殊场合获得的奶酪轮被保存至主人去世，并在葬礼上供宾客食用。作为该传统的遗存，少数奶酪轮在19世纪末至20世纪期间仍被制作并保存用于纪念目的。研究人员从同一阿尔卑斯高山牧场、同一传统半硬质涂抹成熟奶酪品种Raclette du Valais的保存奶酪轮中，获得了8块保存完好的样本，生产时间跨越1875年至2017年共142年，构成了一部独特的年代学档案，用于追踪奶酪制造关键阶段中的微生物动态。这些奶酪轮由位于瑞士瓦莱州Grimentz的Zufferey家族地窖保存。需要说明的是，1944年的奶酪轮产自Chateaupré高山乳品厂（约海拔2250米），该牧场与Moiry乳品厂位于同一山谷，后因1958年Moiry大坝建成而被淹没；其余样本均产自Moiry高山牧场（海拔2497米，为瑞士最高奶酪乳品厂）。
三、主要技术方法
研究人员运用多种宏基因组学和生物信息学方法开展研究。对8块奶酪轮样本（1875、1944、1957、1975、1985、1991、2010、2017年）进行了鸟枪法宏基因组测序和16S rRNA基因（V1-V2区）扩增子测序。前1970年代样本在古代DNA洁净实验室中处理，后续样本在现代DNA提取实验室中采用同等防污染措施。DNA损伤模式分析采用DamageProfiler和EAGER流程评估古DNA降解特征并去除损伤末端（修剪6 bp）。宏基因组数据通过ATLAS流程进行组装（SPAdes）、分箱（MaxBin、MetaBAT）和功能注释；抗生素抗性基因以ResFinder数据库和fARGene工具鉴定；噬菌体以geNomad鉴定、vContact2聚类、iPHoP预测宿主、CheckV评估基因组完整性；CRISPR间隔序列从宏基因组原始读段中提取并与已知噬菌体数据库比对。细菌群落组成基于DADA2处理16S rRNA扩增子数据并用DAIRYdb数据库进行物种注释。此外，通过核心基因组比对和FreeBayes鉴定单核苷酸多态性（SNPs），并利用OrthoFinder构建核心蛋白组系统发育树以评估驯化印记。
四、研究结果
（一）奶酪基质中DNA在142年间保存完好
宏基因组测序每样本获得47–122 Gb数据，原核读段占45%–85%，真核读段（平均33%）主要来自牛，并检出绵羊和山羊DNA（在2010和2017年样本中消失），表明该高山乳品厂直至三十年前仍使用绵羊和山羊乳。DNA损伤分析显示，3′和5′末端损伤频率为0.3%–5%，在片段前6 bp内急剧下降，降解信号随时间显著递减（每年0.028%；R2=0.51，p<0.001）。1875年样本末端损伤频率为4%–5%，与16–17世纪口腔微生物组相当，远低于中世纪和古代样本，表明奶酪是微生物DNA长期保存的稳定基质。
（二）细菌群落变化反映20世纪奶酪制造现代化
16S rRNA扩增子测序共获得1,326个扩增子序列变异（ASVs），归属305个细菌物种，分为发酵剂乳酸菌（SLAB）、乳源细菌、动物相关细菌和其他细菌四类。1875年样本与其他样本显著不同，主要表现为动物相关严格厌氧菌（21.1%）、P. laudensis（11.1%）和植物相关的L. paraplantarum（28.9%）高丰度，后者可能源于当时使用的犊牛皱胃酶（动物相关菌）和植物源性乳腺炎治疗或乳品厂环境（L. paraplantarum）。从1875年到1944年，群落组成变化反映了从自发期向手工期的转变，此时中温SLAB（Lactococcus lactis和L. cremoris）占主导。1985年起，嗜热SLAB显著增加，标志着以商业发酵剂为特征的标准化期开始。2017年样本以S. thermophilus、L. lactis和L. cremoris为主，但非发酵剂乳酸菌（如L. paracasei）丰度较低。亚优势物种（<0.1%）的累积相对丰度随时间下降（线性模型：R2=0.49，p=0.014），但物种丰富度和Shannon多样性无显著下降，科水平丰富度则随时间降低（R2=0.3179，p=0.0663）。
（三）遗传特征保守而抗生素抗性基因呈现时间波动
功能宏基因组分析共获得37个高质量MAGs（完整度>90%，污染<5%），包含96,070个基因家族。基因丰富度随时间下降，表明功能潜能逐步收窄，与生产条件日趋受控一致。核心奶酪相关性状（酸化、酪蛋白降解）在所有时间点稳定存在。抗生素抗性基因（ARGs）分析显示，1875年和2017年MAGs中未检出获得性临床ARGs，而1944–2010年样本中含有6种临床ARGs：tet(S)（四环素类，仅在1975年样本的L. lactis MAG中高丰度检出，与瑞士1956–1973年四环素类作为促生长剂使用的历史一致）、cat（氯霉素类，1991年样本）、class A1 β-内酰胺酶（β-内酰胺类，1975–2010年）、nar(A)（那拉星类，1944年样本）、str_2（氨基糖苷类，1957–1991年连续四个样本）和class A2 β-内酰胺酶（β-内酰胺类）。ARGs在抗生素引入畜牧业后出现频率增加，并在此后监管措施实施时趋于消失，提示农业中抗生素使用对ARGs传播的驱动作用及监管措施的可能效果。
（四）主要乳酸菌驯化早于研究覆盖时期
对S. thermophilus和L. lactis核心基因组核苷酸多样性（每100 bp 0.005–0.1个SNPs）的检测未发现随时间显著下降的趋势；MAGs与其最近系统发育邻居的距离稳定，无随时间增加的趋势；基因和假基因数量亦无时间性减少的证据。这些结果表明，在1875年之前主要乳酸菌的驯化已经完成，后期标准化发酵剂的使用更多是对特定菌株的筛选而非菌株内部的持续演化。
（五）噬菌体群落稳定
共鉴定出68个独特噬菌体（≥99%同一性、≥85%覆盖度），其损伤模式与细菌一致，确认为古噬菌体而非现代污染。噬菌体丰富度无显著下降（p=0.159），病毒载量仅有边缘性上升（p=0.08）。约21%噬菌体contigs与链球菌宿主相关，38%与乳球菌相关。主要噬菌体属（包括Skunavirus、Ceduovirus和P335群）整体上随时间共存，未观察到清晰的属水平时间转变。值得关注的是，P335群前噬菌体在几乎所有样本中检出，而严格溶菌性乳球菌噬菌体Skunavirus和Ceduovirus仅从1985年后才被检出。S. thermophilus CRISPR间隔序列分析（共1,179个间隔序列，85%为单个样本独有）显示，14%可匹配已知噬菌体靶标，主要为链球菌噬菌体Moineauvirus（69%）和Brussowvirus（20%）属——这两个属也是当今乳品工业中最主要的噬菌体类群。综合宏基因组学和CRISPR证据，表明150年来噬菌体群落及其与宿主的相互作用在该奶酪生产体系中保持相对稳定。
五、总结与结论
本研究的核心结论如下：利用瑞士瓦莱州独特的奶酪保存传统，研究人员对同一地点、同一类型的传统奶酪跨越三个世纪（1875–2017年）的微生物动态进行了直接分析。研究揭示，生产实践的变迁驱动了奶酪微生物群落组成和功能多样性的逐步收窄，尤其是从自发发酵到手工发酵剂再到商业标准化发酵剂的转变，在细菌群落组成上留下了清晰的阶段性印记——1875年样本中肠道和植物相关类群的高丰度反映了使用犊牛皱胃酶和传统乳品实践的时期，而1985年后嗜热SLAB的兴起标志着商业发酵剂时代的到来。抗生素抗性基因的时间动态与历史上兽用抗生素的使用和后续监管措施高度吻合，从1875年和1944年的无/单一ARG到20世纪后半叶多种ARGs的出现，再到2017年的消失，表明奶酪微生物组可作为人为选择压力的记录器。值得注意的是，乳酸菌主要驯化事件和噬菌体群落的建立均早于本研究所覆盖的时间窗，标准化发酵剂的引入更多表现为对特定菌株的选择而非其基因组内的持续演化。
本研究的局限性在于样本量有限且缺乏生物学重复，限制了对单个类群、基因和菌株存续时间的精确推断，因此结论侧重于宏观趋势。尽管如此，该研究首次在连续的时间序列中直接检验了工业化对食品发酵微生物组的长期影响，证明历史奶酪档案具有恢复古微生物DNA并进行物种、功能和菌株水平分析的潜力。现代宏基因组学和实验重建技术已使复现150年前的历史奶酪群落成为可能，未来研究可在其他奶酪类型中验证这些趋势，并重建历史生产条件以进一步阐明人类创新如何持续塑造发酵食品的微生物生态系统。
