《Expert Opinion on Drug Discovery》：The rapid emergence of small molecule RNA modulator hit discovery: unlocking the potential
摘要
引言：RNA现被认作是主动的调控靶标，而非被动中介，由此拓展了超越以蛋白质为中心的药物发现的治疗机会。小分子RNA调节剂为难以直接成药（druggable）的蛋白质靶标提供了进入新靶标空间和调控的新机制，但临床转化仍然有限。
涵盖领域：本综述考察了小分子RNA靶向命中发现（hit discovery）中的主要挑战与机遇：基于遗传学、结构和功能的靶标优先级排序；除剪接（splicing）之外的调节机制，包括翻译干扰（translation interference）和靶向RNA降解（targeted RNA degradation）；RNA结构结合与功能结果之间持续存在的差距；命中发现策略；以及命中至先导优化（hit-to-lead optimization）。在此，研究人员讨论了局限性不仅在于识别RNA结合剂，更在于前瞻性地预测结合至特定RNA结构是否会产生功能后果。
专家意见：取得进展需要闭合结构-功能-可药性循环（structure-function-druggability loop），途径包括：胞内验证和RNA特异性可药性模型；部署靶向RNA降解以将沉默结合剂（silent binders）转化为功能分子；建立标准化的验证级联（validation cascades）和转化性PK/PD框架；构建RNA本征化学基础设施；以及在RNA特异性数据集上训练人工智能（artificial intelligence, AI）。用于生成共享结构和功能数据的竞争前基础设施（pre-competitive infrastructure）将加速该领域发展。
关键词：RNA靶向小分子（RNA-targeting small molecules）；RNA结构（RNA structure）；可药性RNA（druggable RNA）；命中鉴定（hit identification）；靶标选择性（target selectivity）；命中至先导优化（hit-to-lead optimization）；靶向RNA降解（targeted RNA degradation）；人工智能（artificial intelligence）
主体内容总结
1. 引言
RNA长期被视为DNA与蛋白质之间的基本中介。然而，过去二十年间对其生物学作用的理解显著拓展，为药物发现提供了新机遇。转录组分析显示人类基因组70-80%被转录为RNA，但仅约2%编码蛋白质。遗传学、转录组学和功能基因组学研究确立了非编码RNA、长链非编码RNA、microRNA等物种在基因调控、细胞稳态和疾病中的关键调控作用。因此，以RNA为靶标的小分子提供了两大战略机遇：通过上游RNA干预间接调节传统上难以成药的蛋白质靶标，以及通过非编码转录本进入新型生物学空间。2020年美国食品药品监督管理局（FDA）批准risdiplam（Evrysdi?）为口服生物利用小分子调节RNA生物学的临床验证提供了证据。尽管临床前研究已扩展至病毒RNA、重复扩增、前体miRNA和lncRNA，但除剪接调节外的临床转化仍然有限。屏障不仅在于识别RNA结合剂，更在于前瞻性预测结合至特定RNA结构是否会产生功能后果。RNA构象动态、有限化学先例以及缺乏经验证的RNA特异性可药性框架均导致这一结构-功能差距。本综述围绕RNA靶向项目面临的序列决策组织，从靶标优先级和机制选择开始，进而考虑结构-功能关系、命中发现和命中至先导优化。
2. 优先选择具有战略地位的RNA靶标
2.1 基于人类遗传学进行靶标提名
RNA定向小分子的靶标提名应尽可能以人类遗传学证据为基础。疾病中基因产物因果作用的遗传支持（通过全基因组关联研究、罕见变异分析或孟德尔遗传学）大幅降低了因缺乏临床疗效而失败的风险。遗传见解必须在RNA水平解读：因果变异是否改变剪接、转录本稳定性、翻译、产生异常RNA结构或驱动毒性功能获得性重复扩增。移码或剪接位点变异导致的基因功能部分缺失或获得提示了调节内源RNA或蛋白质的策略；由无义介导的衰变（nonsense mediated decay, NMD）途径降解的变异可用于降低蛋白质水平；非翻译区（untranslated regions, UTRs）中的毒性重复扩增可能适合通过小分子直接结构破坏。孟德尔随机化和表达数量性状位点（expression quantitative trait locus, eQTL）分析有助于定义所需效应大小以及基因表达级联中最可能有效干预的水平。
2.2 优先选择具有功能相关RNA结构元件的靶标
决定针对特定靶标采用小分子RNA靶向策略后，最关键的问题是目标RNA是否采用可充当小分子结合位点的明确三维结构基序。发夹环、内部凸起、连接区、假结和G-四链体（G-quadruplexes）等基序可形成具有形状互补性和静电特性的离散空腔以利于配体结合。整体柔性或本质上无序区域通常不太可能提供治疗开发所需的选择性，尽管瞬态构象也可能暴露可配位位点。预测的口袋是潜在可配位性的证据，而非功能性可药性。相关特征包括口袋几何形状、形状互补性、构象可及性、局部化学官能团以及支持选择性而非非特异性相互作用的静电环境。fpocketR等工具可识别潜在RNA口袋，相关模型从三维结构估算可配位性。然而其预测取决于输入结构的质量和生物学相关性。口袋可能容纳化合物而不将占据与相关输出耦合。相反，功能重要位点可能是瞬态的、在静态结构中代表性不足或仅在RNA-蛋白质复合物中形成。RNA语言模型、结构预测方法和几何深度学习方法有助于在大量RNA靶标中优先选择保守结构元件、替代折叠、调控区域和候选口袋。使用SHAPE、DMS、冷冻电镜或NMR衍生数据进行实验约束建模可提高预测结构的生物学相关性。这些方法应产生可测试假说而非可药性的确定性证据。前瞻性工作流程因此应结合遗传和功能证据、结构预测、构象系综分析、口袋评估和靶向功能扰动。
2.3 部分调节作为治疗设计原则
RNA靶向方法一个常被低估的特征是靶标活性的部分调节可能足以或优于完全消除。这尤其适用于单倍剂量不足或毒性RNA/蛋白质水平降低引起的疾病。剪接调节方法提供了既定范例：内源RNA加工缺陷的部分纠正可产生治疗益处。脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）实例说明从低基线增加功能性SMN蛋白可在不完全正常化的情况下产生治疗益处。在作用机制和剂量-反应关系得到充分表征的前提下，应考虑部分调节。
2.4 靶向RNA实现蛋白质上调
除沉默方法外，一个重大且未充分开发的机遇在于利用RNA靶向小分子上调蛋白质表达，用于蛋白质替代或基因增补不可行的功能缺失性疾病。三种RNA调控机制尤具相关性：剪接转换（splice switching），调节外显子包含或排除以恢复正确阅读框、去除显性负性外显子或挽救提前终止；上游开放阅读框（upstream open reading frame, uORF）调节，破坏抑制性翻译元件以解除规范蛋白质合成的抑制；天然反义转录本（natural antisense transcript, NAT）抑制，抑制施加表观遗传沉默的顺式作用非编码RNA以增加有义基因转录。特定靶标的优选方法应由哪个调控机制主导靶标位点的内源控制以及所需治疗窗口决定，这些考虑直接影响级联设计和优化策略。该理由必须辅以对内源靶标参与、功能活性和选择性的早期评估。
2.5 降低RNA作为小分子药物靶标的风险
三个风险需早期关注。第一，选择性谱分析：疾病相关细胞中的转录组-wide RNA测序可检测脱靶剪接或翻译效应；branaplam相对risdiplam不同的脱靶剪接负担说明这是不可协商的。第二，体内靶标参与确认：应在动物模型以及可能的人类组织或体液中建立药效学生物标志物（如外显子包含比率和蛋白质水平）。第三，优先选择具有一定生物学或临床理由的靶标可增加对基础生物学的信心，特别是在蛋白质水平干预不可行时。然而，缺乏先例不应排除有说服力的RNA靶标。
3. RNA调节机制：超越剪接
小分子可通过多种不同机制调节RNA生物学，每种机制产生不同功能结果且通常需要不同筛选级联设计。其中剪接调节仍是研究最深入且临床验证最充分的机制，但其他机制方法正进入临床前空间。对阿斯利康治疗领域RNA靶向评估的分析显示剪接调节占主导地位，反映其临床成熟度和稳健功能读出的可用性；5' UTR和3' UTR元件介导的翻译调节占比可观且持续增长，尤其在肿瘤学和心血管、肾脏及代谢疾病（cardiovascular, renal and metabolic diseases, CVRM）领域；lncRNA调节在罕见病背景下出现。若干靶标未产生明确优选机制，强调机制选择本身仍需多种证据汇聚。
3.1 剪接调节
剪接调节是临床最先进的小分子RNA靶向机制。小分子可通过结合剪接位点附近或剪接位点的RNA或RNA-蛋白质复合物改变前体mRNA剪接。通过识别结构化基序，这些分子改变外显子包含或排除以纠正致病异构体，从而恢复功能蛋白或减少毒性变异体。risdiplam的批准验证了这一机制的临床有效性并催化了多个治疗领域额外剪接调节剂的开发。risdiplam和branaplam的临床先例证明小分子可实现足以从低基线恢复功能性蛋白表达的外显子水平选择性。剪接调节剂在临床格局中的主导地位不仅反映剪接位点结构的可处理性，也反映稳健功能读出（如外显子包含比率）的可用性。Silvestri等人描述了一种机制上不同的策略：小分子抑制细菌II型内含子催化中心，这些自剪接核酶在进化上和结构上与真核剪接体催化核心相关。共晶结构数据提供了配体在催化中心内结合的直接证据。尽管这些发现未确立对真核剪接体的选择性靶向，但为靶向RNA催化中心而非仅剪接位点或RNA-蛋白质界面提供了结构先例。
3.2 无义抑制和通读
促进核糖体绕过提前终止密码子（premature termination codons, PTCs）的小分子可在无义突变引起的疾病中恢复全长蛋白质产生。氨基糖苷类抗生素通过结合核糖体解码位点并在高浓度下诱导密码子-反密码子错认提供了早期概念验证，为ataluren等设计通读化合物奠定了基础。然而通读化合物面临特定优化挑战，需要高特异性以避免抑制正常终止密码子，同时诱导足够功能蛋白以改变疾病表型。治疗窗口狭窄，区分真正PTC通读与非特异性翻译保真度下降在筛选和临床开发中均被证明困难。
3.3 翻译干扰
小分子可通过结合成熟mRNA和病毒RNA内结构化元件调节基因表达。核糖开关提供了完善实例，配体结合代谢物或离子感应RNA结构调节基因表达。治疗和翻译实例证明了该机制的广泛可行性，例如NRAS 5' UTR中RNA G-四链体的参与已被报道抑制NRAS翻译。高度结构化的丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）提供了相关实例：靶向IRES的小分子可破坏帽非依赖性翻译所需相互作用。人类mRNA也可能含有抑制下游编码序列翻译的抑制性uORF。改变uORF起始或破坏抑制性5' UTR结构（包括rG4s）的小分子因此可通过内源调控元件增加蛋白质输出。结构化3' UTR元件提供了调节mRNA稳定性的互补机会。干扰HuR与AU富集元件（ARE）或G3BP1结合3' UTR rG4相互作用的化合物已被报道使mRNA不稳定。相反，小分子结合3' UTR也可干扰miRNA结合，从而稳定成熟mRNA。这些机制可能与功能缺失性疾病特别相关，尽管其成熟度仍低于剪接调节。
3.4 靶向疾病相关重复扩增
重复扩增代表了一类独特靶标，其中小分子参与致病RNA结构可同时解决多个下游致病机制。与肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）和肌强直性营养不良等神经和神经肌肉疾病相关的异常扩增重复RNA序列可采用发夹、内部环或G-四链体。这些病理RNA可螯合RNA结合蛋白（如肌强直性营养不良中的MBNL1导致广泛错误剪接），形成破坏性核RNA灶，损害翻译，通过非经典重复相关非AUG（repeat-associated non-AUG, RAN）翻译产生毒性肽，并与RNA质量控制途径异常相互作用。小分子已被报道结合DMPK中r(CUG)exp、FMR1中r(CGG)exp、CNBP中r(CCUG)exp以及C9orf72中r(G4C2)exp。细胞和小鼠模型研究报道了重复相关病理的调节，但尚无靶向该机制的小分子项目进入临床开发。靶标的重复性质也提供了潜在药理学优势，因为每个转录本多个结合位点可在可达药物浓度下增强占据和功能效应。
3.5 破坏RNA-蛋白质相互作用
该领域一个基本问题是裸RNA是否代表细胞环境中现实的药物靶标，或者功能相关RNA是否主要存在于核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物中。若干小分子已被证明破坏蛋白质与RNA之间的结合，尽管在某些情况下小分子结合RNA、蛋白质还是两者界面仍不清楚。例如靶向HIV反式激活反应（Trans-Activation Response, TAR）元件的化合物可阻断病毒反式激活蛋白Tat与TAR元件的结合，阻止转录延伸因子招募，从而抑制病毒蛋白转录。解析活性是源于直接RNA参与、蛋白质参与还是RNA-蛋白质界面破坏，对级联设计和作用机制解析至关重要，因为每种机制需要不同验证策略。
3.6 调节非编码RNA
非编码RNA代表了一类庞大且功能多样的转录本，在多个水平调节基因表达。其失调与众多疾病状态相关，但作为小分子药物靶标仍未充分开发。小分子可通过破坏miRNA-mRNA相互作用或靶向前体miRNA加工中的结构元件调节miRNA生物学。然而在给定细胞类型中表达的数百种miRNA中实现单一miRNA选择性仍具挑战，因为前体发夹结构相似。天然反义转录本（NATs）提供了蛋白质上调的互补途径。这些顺式作用lncRNA在有义启动子处施加表观遗传沉默。因此抑制BDNF-AS等NAT转录本可使有义基因转录增加2至7倍。更广泛地，靶向lncRNA可调节染色质重塑、转录干扰和蛋白质复合物支架。MALAT1三螺旋结构已支持小分子配体的发现，最近PINAD-1的开发将三螺旋结合剂与咪唑类RNA切割弹头连接，在体外和细胞中选择性降解MALAT1。小分子破坏Xist结构也被证明干扰X染色体失活。然而低丰度、亚细胞定位、RNA-蛋白质相互作用和背景依赖功能继续使治疗转化复杂化。
3.7 靶向RNA降解或失活
RNA降解小分子代表了一类快速增长的模式，解决了RNA靶向药物发现中的基本挑战：功能性沉默结合剂普遍存在。双功能降解分子通过招募RNA降解机制至靶转录本，将可能缺乏内在调节活性的RNA结合化合物转化为功能性治疗分子。已描述两种架构。RIBOTACs（ribonuclease-targeting chimeras）通过包含RNA结合弹头连接RNase招募部分（典型为RNase L）的双功能设计招募内源RNase至靶RNA结构。PINADs（proximity-induced nucleic acid degraders）利用邻近诱导的咪唑介导RNA切割，无需招募细胞酶。共价RNA修饰剂通过直接化学修饰使转录本不可翻译，代表靶向转录本失活的进一步方法。这些模式可扩展否则可能被降优先级的RNA结合化合物的效用。然而靶向RNA降解仍处于早期阶段，催化周转、RNase选择性、转录本水平选择性、分子大小和理化可处理性仍未解决。降解主要适用于抑制性结果，不直接提供蛋白质上调途径。
4. 将RNA结构与功能和可药性联系起来
将RNA靶向命中转化为治疗需要RNA结构、配体参与、功能和可药性之间的因果联系。当前方法主要是回顾性的，而非提供前瞻性评估，且很少确定所识别结构特征是否控制所测表型或代表功能性可药位点。
4.1 结构-功能联系问题
RNA药物发现中的核心挑战是确定复杂动态RNA分子中哪些结构特征负责功能调节，以及小分子扰动这些特征是否会产生预期药理学效应。与蛋白质不同，RNA缺乏等效的预测知识库。最直接的困难是结构观察不意味着功能相关性。SHAPE和DMS等化学探测方法以单核苷酸分辨率映射灵活性，但无法区分控制调控开关的基序与仅热力学稳定的基序。基于突变的方法如M2-seq试图弥合此差距但无法建立因果性：功能效应可能源于蛋白质结合位点的序列破坏而非结构变化。ASO铺盖识别敲低敏感区域，但有效ASO位点常缺乏适合小分子的口袋几何形状，且ASO作用机制与口袋占据根本不同。RNA以构象系综而非单一结构存在加剧了此问题。DANCE-MaP证明7SK RNA的两种功能不同状态在细胞中共存但在系综平均数据中不可见。原子力显微镜揭示核糖开关活性取决于异质状态间的群体平衡。即使特征看似稳定，非细胞与细胞背景之间也存在进一步脱节。体外探测无法捕捉细胞中塑造RNA的拥挤、蛋白质相互作用或离子条件。细胞内方法减少了此差距但引入复杂性——探测试剂修饰蛋白质并破坏RNA-蛋白质相互作用。
4.2 可药性评估差距
即使RNA折叠包含结构上合理的口袋，预测有用亲和力和选择性仍然困难。RNA可药性评估不如蛋白质成熟，因为结构和配体结合数据集有限，口袋架构与功能调节之间的联系尚不明确。RNA结合位点通常浅、带电且溶剂暴露，因此静电和氢键相互作用可产生亲和力但缺乏足够化学特异性。典型基序如规范茎环可支持广泛且潜在非特异性参与。计算方法可帮助优先选择候选RNA位点和化合物。口袋检测工具如fpocketR识别潜在RNA口袋，DRLiPS从三维结构预测可配位性。结构预测方法特别是受SHAPE、DMS、NMR或冷冻电镜数据约束时可生成候选折叠和构象体用于口袋分析和虚拟筛选。几何深度学习方法提供互补方法。然而预测的结构置信度、口袋几何形状或可配位性不确立功能性可药性。RNA动态进一步使计算评估复杂化。针对单一结构的对接可能错过替代折叠、瞬态口袋或配体诱导重排。系综对接、分子动力学和增强采样方法可解决此限制，但可靠性取决于输入系综质量、力场精度、离子处理和预测状态的动力学可达性。转录组-wide谱分析强调结合水平和功能水平选择性可能不同。共价片段映射识别了稳定非翻译区结构的广泛参与，而功能选择性在片段转化为转录本选择性RIBOTACs后实现。选择性因此可通过作用机制工程化而非完全由初始结合事件决定。
4.3 RNA动态和配体识别
上述限制被RNA系综的动态和异质性质放大。相关治疗靶标不一定是单一主导折叠而是构象系综，其中个体状态在表面结构、口袋可及性和可配位性上可能不同。关键问题是足够群体化或动力学可及的状态是否呈现可处理结合位点，以及配体结合是否将系综转向期望结果。配体识别可能涉及构象选择、诱导拟合或两者组合。分子拥挤已报道通过改变构象互换的动力学和热力学将核糖开关识别从构象选择转向诱导拟合。生化与细胞效力差异可能反映结合机制的真实转变而非内在化合物变异。这种构象异质性为筛选和建模创造挑战。针对单一结构的对接可能错过相关结合模式或有利于非功能构象。激发构象状态是瞬态、稀疏群体的构象体，其中局部波动可暴露基态不可及的沟或口袋。基于化学交换饱和转移和弛豫分散的NMR方法已表征多种RNA中的此类状态。小分子可能优先结合并稳定这些构象体，可能扩展可药RNA空间。RNA动态还引入平衡亲和力未捕获的动力学维度。当结合涉及稀疏群体状态的构象选择时，观察到的结合速率可能强烈依赖于RNA形成和补充接受构象的速率。细胞靶标参与因此将取决于亲和力、构象交换、配体浓度、竞争、RNA丰度和靶标周转。
4.4 无机制解析的结构性RNA靶向
动态和动力学测量可确定配体如何参与RNA系综，但不确定该参与的功能后果。即使结合在结构上、生物物理上和细胞中得到确认，仍可能不清楚局部扰动如何传播至生物结果。RNA功能常依赖于长程变构网络，其中局部变化通过三级接触或构象耦合调节远处调控元件。结合5' UTR元件的分子可能增强翻译、抑制翻译或不产生效应，完全取决于扰动如何与核糖体招募耦合。risdiplam说明RNA靶向的潜力和局限。它识别SMN2外显子7-内含子7连接处的嘌呤富集元件并稳定与U1 snRNP的三元复合物促进外显子包含——但此机制是回顾性解析而非事先预测。获批药物验证了结构依赖性调节，同时展示缺乏系统识别等效机会的预测工具。与许多蛋白质靶标不同，RNA口袋通常不提供相同机制逻辑。配体可能稳定生产性构象、破坏调控相互作用、招募效应器或结合而不影响功能。功能性可药性必须通过将RNA参与与内源分子和疾病相关表型结果联系来经验确立。
4.5 走向连接RNA结构、功能和可药性的预测框架
RNA可药性不能仅从口袋几何或亲和力推断。治疗相关位点必须存在于细胞RNA系综中、可被化合物接近、化学可处理且与疾病相关输出功能耦合。需要统一框架整合RNA结构、动态、功能和可配位性。icSHAPE和Nano-DMS-MaP等细胞内方法有助于确定候选结构是否在天然细胞背景中出现。结合化合物处理探测、生物物理确认、功能读出和细胞表型的机制验证级联应逐步将RNA参与与功能结果联系起来。计算模型应优先选择候选区域、构象体、口袋、化合物和实验，但不应取代因果验证。其预测价值将取决于连接RNA序列和结构至构象动态、配体结合、细胞参与、功能输出和选择性的数据集。针对功能结果而非仅亲和力或口袋几何校准的模型将是前瞻性预测治疗可药性所必需的。
5. 小分子调节RNA的命中发现策略
实验命中发现技术仍是识别RNA调节化学起点的基础。尽管计算机和虚拟筛选方法已成功应用，其效用仍受限于对RNA-小分子识别、RNA构象柔性和经过验证的RNA结合化学型稀缺的理解。实验筛选多样化化学库因此对命中发现和生成改善预测模型所需数据集均至关重要。当前方法可广泛分类为基于亲和力的方法或基于细胞的报告基因测定。生物化学测定如荧光偏振（fluorescence polarization, FP）可部署但需要预先了解结合相互作用或蛋白质伴侣。
5.1 基于亲和力的筛选
亲和选择质谱（affinity selection mass spectrometry, AS-MS）和荧光指示剂置换（fluorescent indicator displacement, FID）测定等基于亲和力的筛选技术可快速识别结合分离RNA靶标的小分子。这些方法促进快速、风险筛选，提供早期靶标参与确认。FID测定提供指示剂置换的高通量检测，需要下游分选以区分真正口袋结合剂与竞争插入位点的化合物。AS-MS提供直接结合测量但易受静电非特异性结合和插入影响。NMR对RNA特别有价值，可确认靶标结构、结合位点定位和选择性评估，并可配置用于数千个片段的主要筛选。所有亲和力方法的共同考虑是结合本身不保证转化为细胞活性。SHAPE探测可用于比较体外和细胞中的结构系综。基于亲和力的方法也常规识别因与带负电RNA骨架静电相互作用和混杂插入产生的非特异性结合剂。非特异性化合物可能以更大表观亲和力或更高测定响应结合。区分两者因此既必要又具挑战性，需要广泛的orthogonal生物物理验证。亲和力方法可在三种背景下提供战略价值：RIBOTAC和PINAD降解策略、无法在主要筛选规模配置功能测定的靶标、以及快速早期去风险工具。
5.2 基于细胞的报告基因测定
基于细胞的报告基因测定提供了替代筛选范式，可在生理相关背景下进行RNA调节的功能评估。这些系统采用置于靶RNA下游的报告基因（典型为荧光素酶），根据期望作用机制设计。剪接调节剂报告基因整合入小基因构建体，剪接驱动移码产生报告基因表达变化。翻译或稳定性调节剂报告基因通常置于5' UTR或3' UTR元件下游。HiBiT互补测定平台已出现用于测量mRNA翻译或RNA-RBP相互作用。基于细胞方法的关键优势在于其再现天然细胞环境的能力，包括RNA-RBP相互作用、竞争性RNA物种以及转录和翻译调控机制。剪接报告系统对发现SMN2剪接调节剂至关重要。然而报告系统面临重大技术挑战：需要广泛质粒工程和稳定细胞系生成，依赖可能不完全反映内源RNA生物学的过表达系统，且在进行大规模HTS活动前常缺乏经过验证的工具化合物。
5.3 命中发现级联设计
下游验证级联的设计对成功命中识别活动与主要筛选测定同等关键。最佳筛选测定序列取决于提名RNA区域、预期作用机制和近端功能读出的可用性。亲和力优先方法提供早期RNA参与证据，而基于细胞的筛选可在不需完全机制理解的情况下识别功能活性。在资源允许时，并行部署两种策略可提供互补信息。在基于亲和力的命中识别和生物物理确认之后构建稳健筛选级联目前具有挑战性，通常需要在缺乏中间生化验证步骤的情况下直接进入细胞功能测定。此差距可能使在初始细胞测定中看似弱或无活性的化合物被降优先级，但这些化合物不应自动丢弃，特别是在考虑靶向降解时；它们可能代表功能性沉默结合剂并提供RIBOTAC或PINAD开发的弹头。相反，通过基于细胞的报告基因测定识别的化合物需要确认表型源于预期RNA机制而非脱靶蛋白质或途径抑制、报告基因干扰、细胞应激或非特异性RNA降解。应尽可能使用内源测定。RT-qPCR可测量选择性剪接、RNA丰度或转录本稳定性，而蛋白质水平测定可确定改变的RNA加工或翻译是否产生预期生物效应。计算方法可支持级联设计，通过优先选择候选构象体、结合位点或化学多样化合物。主动学习工作流可整合每个设计-制造-测试循环中的结合、结构探测、靶标参与和功能数据以选择后续化合物或实验。
6. 命中与先导优化
识别有前景的命中后，下一步是优化化学系列的效力和性质以达到期望临床候选谱。RNA结合小分子可存在于类药理化空间中，尽管其性质可能与蛋白质结合剂略有不同。R-BIND库分析发现RNA结合剂相比蛋白质结合剂更倾向于带正电、含更多（杂）芳香环、氮含量更高且采用更多棒状形状。因此尽管RNA靶标小分子命中优化的公开实例有限，优化RNA结合分子的总体策略应在许多方面类似蛋白质靶标，但需考虑若干RNA特异性问题。
6.1 RNA结构-based药物设计的局限性
结构-based药物设计（structure-based drug design, SBDD）策略对RNA靶标比对蛋白质靶标更具挑战性，因为RNA构象柔性且常呈现溶剂暴露、高度带电的结合位点。这些性质使高质量RNA-小分子结构难以通过X射线晶体学或冷冻电镜获得。NMR可提供RNA溶液中的代表性视图但通常限于较短RNA序列。小分子可能通过改变RNA构象平衡起作用，因此针对单一结构优化亲和力可能具有误导性。RNA结构和RNA-配体相互作用的计算预测仍不如等效蛋白质方法成熟。RNA构象柔性使结构和亲和力预测复杂化，常需要分子动力学模拟。其带负电骨架和常溶剂暴露的小分子结合口袋常限制为蛋白质靶向设计建立的计算工具的应用。然而RNA靶向药物发现的计算方法正在推进。冷冻电镜或SHAPE约束建模可改善结构预测，RNA适配方法可生成构象系综并预测和排序小分子结合口袋。
6.2 RNA的药代动力学/药效学关系
对于蛋白质靶标，体外-体内相关性预测和人体剂量预测已积累数十年知识。相比之下，对RNA靶标，实现期望药效（pharmacodynamic, PD）效应所需的靶标参与程度或结合亲和力知之甚少。所需亲和力也可能在不同作用机制间差异显著。建议前置研究以理解体外测量亲和力与体内期望PD效应之间的关系。此类研究需要与人类序列高度保守的临床前物种靶RNA。lncRNAs常显示跨物种序列保守性差。某些情况下RNA结构可能比序列更保守，但这产生进一步挑战：需要高精度工具预测三维RNA结构以确定结构保守性是否在序列分歧下维持。
6.3 药物安全性评估考虑
与蛋白质靶标相比，RNA结合小分子的安全性评估需要不同方法。针对疾病相关蛋白质的项目已建立一系列次要药理学panel以评估对已知产生不良效应的脱靶蛋白质的选择性。由于RNA结合分子也可能与蛋白质相互作用，应同样评估其对这些panel的活性。例如若干RNA结合小分子最初被描述为激酶抑制剂。此外必须研究RNA结合剂对脱靶RNA的选择性。一种评估化学系列是否倾向于混杂的早期策略是检查靶向RNA结构基序在转录组中的广泛代表性。研究表明靶向RNA结构越复杂，其广泛丰度的可能性越低，找到选择性RNA结合剂的机会越高。然而鉴于当前精确预测三维RNA结构及其构象景观的限制，纯计算机混杂性评估应谨慎解读。理想情况下选择性评估应结合相关细胞类型中的转录组和蛋白质组分析。由于RNA表达谱在不同细胞类型和组织间差异显著，尚不清楚应选择哪些细胞亚群进行此类研究。肝脏、肾脏、胃肠道和骨髓等器官常与小分子毒理学风险相关，一种务实方法可能是从这些组织衍生的细胞类型开始进行化合物系列的初步毒理学评估。
7. 结论
小分子RNA调节提供了实质性治疗机会。然而尽管多种RNA类别和机制表现出临床前活性，获批药物数量有限，强调该领域的挑战不再是概念验证而是系统和可靠的转化。核心挑战不仅是识别结合RNA的化合物，而是确定动态RNA系综中特定位点的参与是否产生选择性、疾病相关的功能后果。解决此挑战需要整合遗传学、RNA结构和机制的靶标优先级排序。命中发现级联必须同时容纳功能性沉默结合剂和假阳性细胞活性，而命中至先导优化缺乏RNA特异性PK/PD基准、结构设计工具以及针对脱靶蛋白质和脱靶RNA的选择性框架。靶向RNA降解和新兴计算及AI方法提供了扩展可处理RNA靶标范围的互补策略，但两者都需要严格实验验证。进展最终将取决于共享RNA特异性数据集和标准化验证策略，使前瞻性预测而非回顾性解释成为可能。
8. 专家意见
小分子RNA靶向药物发现正处于转折点。机制工具箱、临床先例和新兴技术基础设施现足以使转录组的系统开发成为近期现实目标。该领域面临的问题不再是RNA是否可被小分子成药，而是哪些投资、工具和战略转变将最迅速地将此潜力转化为临床候选物。确定七项优先事项：闭合结构-功能-可药性循环；优先靶向RNA降解；扩展超越剪接机制；构建RNA特异性筛选和化学基础设施；开发RNA特异性选择性框架；推进精准RNA治疗；以及在目的构建的RNA数据集上部署AI。
8.1 闭合结构-功能-可药性循环
最紧迫挑战之一是前瞻性识别小分子结合产生功能后果的RNA靶标。结构口袋识别和可药性评分工具是必要的但不充分，因为即使明确定义的口袋可能功能惰性。进展需要整合细胞内结构映射与功能扰动、反义铺盖和靶向诱变，以确定疾病相关位点机制上不可或缺的结构元件。该领域必须从回顾性结构合理化转向前瞻性机制预测。RNA特异性可药性评分函数针对功能结果校准仍是该领域最高价值的未满足需求之一。
8.2 靶向RNA降解：将沉默结合剂转化为功能分子
靶向RNA降解通过RIBOTACs、PINADs和新兴共价失活方法代表了该领域概念上最有说服力的策略之一，尽管临床验证仍遥远且催化周转、理化可处理性和RNase选择性等重大药理学挑战必须解决。这些模式直接解决沉默结合剂问题，通过将结合与功能调节解耦：任何实现选择性RNA参与的化合物都可成为候选弹头。建立RNA降解剂催化周转能力类似于蛋白质靶向PROTACs是关键优先事项。
8.3 扩展超越剪接：上调机制
上调蛋白质水平的机制对功能缺失性疾病具有特别战略价值，其中部分恢复通常治疗充分。除剪接转换的临床验证外，uORF和抑制性5' UTR结构调节提供调节翻译的途径，天然反义转录本抑制可增加有义基因表达2至7倍。每种机制通过依赖位点特异性调控RNA架构提供内在选择性杠杆。
8.4 RNA特异性筛选技术
新兴测定平台现可实现RNA-蛋白质相互作用的高通量筛选且减少化合物干扰，包括可识别完整细胞中破坏相互作用的基于细胞格式。许多当前报告基因和基于亲和力的筛选方法仍是先前蛋白质靶向技术的改编。令人鼓舞的是RNA定制测定技术开始出现，包括基于点击的互补测定和HiBiT互补体外翻译测定。共价RNA结合剂使用二氮丙啶-炔烃光交联探针在细胞中转录组-wide映射结合位点。DNA编码库（DNA-encoded library, DEL）筛选对RNA先前因DNA标签非特异性结合而具挑战性，但最近进展使DEL对RNA靶标可行。
8.5 RNA特异性化学和选择性
对有效选择性RNA结合小分子构成的理解仍有限。RNA结合剂富集正电荷、杂芳香环系统和棒状形状，但这些是与非特异性结合剂重叠的特征。选择性与靶向基序的结构复杂性相关，建议该领域应积极考虑复杂高阶RNA结构。RNA聚焦化合物库围绕RNA特权支架构建已提供比特意复用多样性集合更多产起点。迫切需要RNA特异性多参数优化框架整合转录组-wide选择性
