《Cancers》：O-GlcNAcylated TCF4 Drives Ferroptosis Resistance and Tumor-Associated Macrophage Infiltration to Promote Colorectal Cancer Liver Metastasis
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中文摘要翻译：背景：结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM）仍是结直肠癌（colorectal cancer, CRC）患者死亡的主要原因，而连接肿瘤细胞适应性改变与免疫微环境重塑的上游分子机制尚不清楚
中文摘要翻译：背景：结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM）仍是结直肠癌（colorectal cancer, CRC）患者死亡的主要原因，而连接肿瘤细胞适应性改变与免疫微环境重塑的上游分子机制尚不清楚。方法：研究人员通过整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）、多组学分析、临床队列及功能实验，探讨了TCF4翻译后修饰（post-translational modification, PTM）在CRLM进展中的作用及机制。结果：研究人员鉴定出O-GlcNAc修饰的TCF4（O-GlcNAcylated TCF4）是CRLM的关键驱动因子。TCF4在CRLM中显著上调，并与不良预后相关。机制上，OGT介导的Ser163位点O-GlcNAc修饰促进了TCF4的核定位并增强其转录活性。O-GlcNAc修饰的TCF4直接激活GPX4转录，赋予肿瘤细胞铁死亡抵抗能力，并维持CRC细胞的恶性特征。此外，TCF4促进CSF1分泌，激活CSF1/CSF1R轴，从而促进肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage, TAM）募集和M2型巨噬细胞极化，进而形成免疫抑制性转移微环境。结论：该研究揭示了O-GlcNAc修饰的TCF4–铁死亡–免疫调节轴在CRLM进展中协调肿瘤内在适应性与微环境重塑，为预防CRLM提供了潜在的治疗靶点。
论文解读文章：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，而结直肠癌肝转移（colorectal cancer liver metastasis, CRLM）是限制患者长期生存的主要临床挑战。约40%–50%的CRC患者会在疾病进程中发生肝转移，此类转移具有早期播散、高侵袭性和显著治疗抵抗的特点。尽管手术切除联合全身化疗、靶向治疗及免疫治疗等多模式策略已在临床实施，但由于肿瘤异质性和术后复发率高，CRLM患者的五年生存率仍不理想。因此，阐明转移性肝微环境形成的分子机制对于开发下一代治疗策略至关重要。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），尤其是肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs），已被认为是肝转移形成的关键调控者。TAMs参与从转移前微环境建立到肿瘤定植的整个转移级联过程。然而，肿瘤细胞内启动TAM募集和极化程序的上游分子事件仍知之甚少。蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs），特别是糖基化修饰，是调控蛋白质组多样性和细胞信号转导的基本机制。异常糖基化模式是恶性肿瘤的标志，广泛参与肿瘤侵袭、转移和免疫逃逸。近年来，糖基化修饰与铁死亡之间的非经典关系日益受到关注。尽管铁死亡抵抗与免疫微环境重塑之间的相互作用已被认为是肿瘤进展的潜在驱动因素，但在CRLM中，特定糖基化事件桥接肿瘤代谢应激反应（铁死亡）和免疫微环境重编程的机制仍不明确。转录因子4（transcription factor 4, TCF4），又称E2-2或ITF2，是I类碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）转录因子，可结合E-box基序。TCF4/E2-2已被认为参与CRC细胞生长、干性和转移，但其翻译后调控及其在结直肠癌肝转移免疫微环境中的作用仍不清楚。目前对TCF4调控的理解主要集中在转录活性层面，而TCF4本身是否受翻译后修饰控制以及此类修饰是否影响其促转移功能，在很大程度上尚未被探索。因此，本研究聚焦于TCF4的糖基化状态，探究TCF4修饰是否作为连接肿瘤细胞铁死亡适应与免疫微环境重塑的关键调控节点。
研究人员通过整合单细胞测序数据和临床CRC队列，发现TCF4是CRLM的关键驱动因子，并赋予肿瘤细胞铁死亡抵抗能力。TCF4在CRLM患者的原发CRC组织中表达升高，并与不良预后相关。在机制层面，TCF4在OGT糖基转移酶介导下于Ser163位点发生O-GlcNAc修饰，这显著促进了TCF4的核定位。在功能上，O-GlcNAc修饰的TCF4不仅赋予肿瘤细胞铁死亡抵抗能力，还通过CSF1分泌的转录激活促进M2型巨噬细胞极化，从而促进肝转移。该研究建立了一个全新的“O-GlcNAc修饰的TCF4–铁死亡–免疫”致病轴，为预防CRLM提供了重要的理论见解和潜在治疗靶点。
研究人员开展研究时主要运用了以下关键技术与方法：整合了公共数据库及临床队列样本（包括TCGA-COAD队列、GSE39582、GSE68468、GSE164522及GSE271719数据集，以及中山大学孙逸仙纪念医院胃肠外科肿瘤实验室的临床组织样本），利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析CRLM微环境中的细胞异质性；采用非负矩阵分解（NMF）算法和加权基因共表达网络分析（WGCNA）及高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）鉴定铁死亡相关分子亚群和核心模块；通过LASSO回归和机器学习算法（随机森林与支持向量机）构建预后风险模型和肝转移诊断模型；运用LC-MS/MS质谱鉴定TCF4的O-GlcNAc修饰位点；结合双荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀（ChIP）验证TCF4对靶基因的转录调控；利用体外共培养体系、裸鼠异种移植和尾静脉注射肝转移模型进行功能验证。
研究结果部分：第一，鉴定结直肠癌中铁死亡相关分子亚群及特征模块。研究人员从GeneCards数据库检索到1522个铁死亡相关基因（FRGs），在TCGA-COAD队列中鉴定出389个差异表达FRGs，并通过单变量Cox回归筛选出25个具有预后价值的基因。基于NMF算法将患者分为C1和C2两个亚群，C2亚群预后显著较差。KEGG和GO富集分析显示C2亚群富集于细胞外基质（ECM）-受体相互作用、黏着斑和胶原蛋白三聚体相关通路，而过氧化物酶体和氧化磷酸化通路显著抑制。ESTIMATE算法显示C2亚群的基质评分、免疫评分更高，免疫抑制成分（髓源性抑制细胞、调节性T细胞和巨噬细胞）浸润显著增加。WGCNA分析鉴定出与C2亚群最显著正相关的黄色模块。第二，开发铁死亡相关预后风险模型和肝转移诊断模型。基于黄色模块特征基因，通过LASSO回归和多变量Cox回归建立八基因预后风险模型，在内部训练、内部验证和外部验证队列中均显示高危组总生存期显著缩短，1年、3年和5年AUC值稳定。进一步构建整合年龄、临床分期和风险评分的列线图。针对肝转移，在GSE68468数据集中通过随机森林算法鉴定出九个核心特征基因（包括TCF4），并建立肝转移特异性诊断列线图。值得注意的是，TCF4同时是八基因预后模型中的高风险因子和预测CRLM的关键特征基因。第三，单细胞测序揭示铁死亡相关恶性细胞亚群及TCF4调控网络。基于GSE164522数据集的73,904个细胞鉴定出11种细胞类型，恶性细胞进一步分为两个亚群，其中cluster 2具有更高的增殖评分和干性特征，被定义为铁死亡相关恶性细胞群（FM）。TCF4在FM群中显著上调。hdWGCNA分析显示青色模块与FM表型强正相关，GSEA揭示FM群中O-糖基化通路显著激活，O-糖基化水平显著升高。伪时间轨迹分析显示O-糖基化评分在细胞命运进程中动态增加。CellChat分析显示FM细胞与巨噬细胞、成纤维细胞和淋巴细胞亚群存在复杂的通信网络。第四，TCF4促进铁死亡抵抗并促进结直肠癌肝转移。临床样本IHC染色显示TCF4在LM阳性CRC组织中表达显著升高，高TCF4表达与较差的总生存期、无复发生存期和进展后生存期相关。体外实验表明TCF4敲低增强erastin诱导的铁死亡，并被铁死亡抑制剂ferrostatin-1和liproxstatin-1逆转，而凋亡、坏死性凋亡和自噬抑制剂无此作用。TCF4过表达则赋予细胞铁死亡抵抗。铁死亡标志物MDA和4-HNE水平在TCF4敲低后升高，过表达后降低。异种移植瘤模型中，TCF4敲低导致的肿瘤生长抑制被liproxstatin-1处理废除。尾静脉注射肝转移模型中，TCF4敲低显著减少肝转移灶形成，而liproxstatin-1处理逆转该保护效应。第五，TCF4在Ser163位点的O-GlcNAc修饰通过调控核转位介导结直肠癌细胞铁死亡抵抗。LC-MS/MS鉴定出TCF4的O-GlcNAc修饰位点为Ser163。OGT敲低降低TCF4的O-GlcNAc修饰水平，S163A突变显著减少TCF4的O-GlcNAc修饰。OGT敲低显著降低野生型TCF4的核表达水平，而S163A突变体的核表达显著降低且不受OGT knockdown影响。S163A突变细胞对erastin诱导的铁死亡更敏感，表现为细胞死亡增加、活力下降和脂质过氧化产物MDA、4-HNE水平升高。在TCF4敲低的CRC细胞中，野生型TCF4回补可恢复核定位并降低铁死亡敏感性，而S163A突变体无法恢复这些效应。第六，TCF4通过直接转录激活GPX4介导结直肠癌细胞铁死亡抵抗。RNA-seq显示TCF4敲低显著降低GPX4 mRNA水平，KEGG和GO分析确认铁死亡相关通路受影响。JASPAR数据库预测GPX4启动子区存在两个潜在TCF4结合位点，双荧光素酶报告实验和ChIP实验证实位点1是TCF4介导GPX4转录调控所必需的。TCF4敲低降低GPX4表达，过表达则相反。OGT敲低抑制GPX4 mRNA水平，S163A突变体无法恢复GPX4 mRNA水平。GPX4敲低废除TCF4介导的细胞活力效应和脂质过氧化产物降低效应。RSL3实验中，OGT敲低和TCF4敲低均未增加CRC细胞对RSL3诱导铁死亡的敏感性，表明TCF4以GPX4依赖性方式特异性调控铁死亡。第七，TCF4促进结直肠癌中巨噬细胞募集和M2样极化。临床样本分析显示CD68+细胞在转移灶中浸润密度显著高于原发灶，LM阳性患者样本中M2型TAMs更多而M1型更少，M2/M1比值显著升高。M1标志物（TNFa、iNOS、CD86）在肝转移中表达降低，而M2标志物（CD206、VEGF、CD163）表达显著升高。Spearman相关分析显示TCF4表达与TAM数量及M2标志物表达相关。共培养实验表明TCF4过表达的CRC细胞促进THP-1来源巨噬细胞迁移和M2极化，TCF4缺陷细胞则削弱该效应。S163A突变体无法恢复M2极化诱导能力。肝转移模型IHC染色显示TCF4敲低组CD206表达显著降低。第八，TCF4通过调控CSF1/CSF1R轴诱导TAM募集和极化。ELISA筛选显示CSF1是TCF4调控下变化最显著的趋化因子。qPCR确认TCF4敲低降低CSF1 mRNA水平，过表达则升高。S163A突变体无法恢复CSF1的表达。肝转移模型和临床样本IHC均显示TCF4敲低或LM阴性样本中CSF1和CSF1R表达降低。JASPAR预测CSF1启动子区存在两个潜在TCF4结合位点，双荧光素酶报告实验和ChIP实验证实位点1为关键调控区域。加入CSF1中和抗体可显著减弱TCF4诱导的巨噬细胞M2极化，表明CRC细胞分泌的CSF1是TAM募集和M2极化所必需的。
讨论部分总结如下：该研究将异常蛋白质糖基化确定为CRLM的关键上游驱动因素，填补了翻译后修饰与TME重塑之间的概念空白，揭示TCF4糖基化是协调肿瘤细胞内铁死亡抵抗和TME免疫逃逸的关键分子开关。该研究首次证明TCF4在CRC细胞中发生OGT介导的Ser163位点O-GlcNAc修饰，扩展了TCF4的调控机制。与肝癌和胰腺癌中糖基化调控铁死亡的不同效应相比，该研究揭示了CRC中O-GlcNAc修饰的TCF4通过转录激活GPX4精确调控细胞内铁死亡抵抗，从而维持肿瘤细胞干性和侵袭能力的独特“促转移”作用。Tcf4–CSF1轴促进巨噬细胞募集并向M2样表型转化，为肝转移微环境建立提供了新机制解释。研究存在以下局限性：肝转移诊断模型仅基于GSE68468数据集且缺乏独立外部验证；临床分析检测的是总TCF4表达而非TCF4 O-GlcNAc修饰水平；未系统评估肺和其他器官的转移负担。未来需在更大规模前瞻性独立队列中验证，并利用原位、脾内或门静脉注射模型探索TCF4在CRC肝转移中的具体作用。研究结论翻译如下：本研究鉴定O-GlcNAc修饰的TCF4为CRLM的关键分子驱动因子，并揭示其在肿瘤细胞适应和免疫微环境重塑中的双重调控功能。研究人员证明OGT介导的TCF4在Ser163位点的O-GlcNAc修饰增强TCF4核定位和转录活性，从而激活GPX4表达并赋予CRC细胞铁死亡抵抗能力。同时，O-GlcNAc修饰的TCF4促进CSF1转录和分泌，激活CSF1/CSF1R信号轴以诱导TAM募集和M2极化，最终形成免疫抑制性转移微环境。靶向O-GlcNAc修饰的TCF4–GPX4铁死亡通路或TCF4–CSF1/CSF1R免疫调节轴可能为CRLM提供有前景的治疗策略。
