《Cancers》：A ZIP-Active Tumor Cell State Defines an NRF2-Associated Ferroptosis-Resistant and Immune-Cold Transcriptional Program in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
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背景/目的：锌稳态已成为癌症生物学的重要调节因素，然而锌转运体相关转录程序在头颈部鳞状细胞癌中的生物学和临床意义仍知之甚少。本研究旨在鉴定锌转运体相关的上皮肿瘤细胞状态并评估其分子和临床意义。方法：研究人员分析了来自一个HNSCC队列的单细胞RNA测序数据，以
背景/目的：锌稳态已成为癌症生物学的重要调节因素，然而锌转运体相关转录程序在头颈部鳞状细胞癌中的生物学和临床意义仍知之甚少。本研究旨在鉴定锌转运体相关的上皮肿瘤细胞状态并评估其分子和临床意义。方法：研究人员分析了来自一个HNSCC队列的单细胞RNA测序数据，以识别与锌转运体表达相关的上皮肿瘤细胞群体并表征其分子特征。随后将ZIP-active转录特征应用于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-HNSCC队列，以评估生物学特性、免疫特征、生存结局以及NFE2L2/KEAP1/CUL3突变状态的影响。结果：研究人员鉴定出一个以SLC39A3和SLC39A4协同上调为特征的独特上皮肿瘤细胞群体，并将其命名为ZIP-active肿瘤细胞状态。该群体表现出NRF2相关的氧化应激适应、谷胱甘肽代谢和铁死亡抑制，同时NRF2活性升高。在TCGA-HNSCC队列中，高ZIP-active评分与氧化应激适应、T细胞相关免疫特征降低以及较差的总生存期相关。NFE2L2/KEAP1/CUL3突变型肿瘤比野生型肿瘤显示出更高的ZIP-active和NRF2相关评分，而NRF2相关代谢特征在两组中均与ZIP活性保持关联。结论：ZIP-active肿瘤细胞状态代表了一种与HNSCC中氧化应激适应、免疫改变和不良预后相关的NRF2连接代谢程序。其在NFE2L2/KEAP1/CUL3突变组间的持续性表明，ZIP活性反映了超越基因组改变本身的NRF2相关肿瘤生物学。
研究背景与科学问题
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是全球第六常见的恶性肿瘤，尽管手术、放疗、全身治疗和免疫治疗取得进展，但其发病率和死亡率仍然较高。临床结局在具有相似临床病理特征的患者间差异显著，反映出HNSCC显著的生物学异质性。单细胞RNA测序技术的进展揭示了多种与增殖、分化、代谢和治疗反应相关的上皮肿瘤细胞状态，凸显了瘤内异质性作为肿瘤行为主要决定因素的重要性。然而，恶性上皮细胞内代谢适应和应激耐受背后的转录程序仍未完全阐明。
锌是一种必需微量元素，参与细胞增殖、抗氧化防御、DNA修复和转录活性调控等多种生物过程。细胞内锌稳态由两个互补的转运体家族严格调控：ZIP（SLC39）家族增加胞质锌可用性，ZnT（SLC30）家族通过外排或胞内隔离减少胞质锌。锌转运体的失调表达已在多种癌症类型中被证实与肿瘤起始和进展有关，特别是SLC39A4（ZIP4）与增强的增殖、侵袭和不良临床结局相关。尽管如此，大多数既往研究聚焦于单个锌转运体，尚不清楚协调的锌转运体活性是否能在HNSCC中定义生物学上不同的肿瘤细胞状态。
在使肿瘤适应的转录程序中，NRF2通路是氧化应激反应和代谢重编程的主调控因子。持续的NRF2激活促进抗氧化防御、谷胱甘肽代谢和对氧化应激的抵抗，并与包括HNSCC在内的多种恶性肿瘤的不良预后和治疗抵抗相关。NRF2还参与与铁死亡抑制相关的转录程序，并最近被证明在塑造肿瘤免疫微环境中发挥作用。尽管NFE2L2、KEAP1或CUL3的激活改变是NRF2激活的经典机制，但积累的证据表明NRF2相关转录程序也可能通过非遗传机制产生。锌转运体相关转录程序是否与NRF2激活、铁死亡相关生物学及HNSCC临床结局相关联，此前尚未得到系统研究。
研究目的与结论
基于前期在HNSCC队列单细胞分析中观察到SLC39A2、SLC39A3和SLC39A4在上皮肿瘤细胞中优先表达，特别是在增殖性上皮群体中，研究人员旨在确定协调的ZIP转运体表达是否能定义HNSCC中一种独特的上皮肿瘤细胞状态，并通过整合单细胞和批量转录组数据集评估其生物学特征、临床相关性以及与经典NFE2L2/KEAP1/CUL3突变的关系。
研究结论：研究人员鉴定出一种此前未被识别的ZIP-active上皮肿瘤细胞状态，其特征为SLC39A3和SLC39A4的协调上调。该状态与NRF2相关的氧化应激适应、增强的谷胱甘肽代谢、与铁死亡抑制相容的转录程序、T细胞相关免疫特征降低以及更差的总生存期相关。NFE2L2/KEAP1/CUL3突变型肿瘤显示更高的ZIP-active和NRF2相关活性，而ZIP活性与NRF2相关代谢特征之间的关联在野生型和突变型肿瘤中均存在，表明ZIP-active程序代表了超越经典NRF2通路遗传激活的一种生物学上独特的转录状态。这些发现为锌相关通路如何促进肿瘤进展提供了新见解，并提示ZIP-active状态反映了超越基因组改变本身的NRF2相关肿瘤生物学。
主要关键技术方法
研究人员从Gene Expression Omnibus数据库获取单细胞RNA测序数据（GSE164690），包含来自14例原发HNSCC标本的CD45阳性和阴性细胞。使用Seurat进行预处理、标准化、降维聚类和差异表达分析；通过xCell和谱系标志基因进行细胞类型注释；利用Slingshot重建细胞分化轨迹。转录因子活性通过DoRothEA调控子资源和VIPER算法推断。在TCGA-HNSCC队列（520例患者）中进行验证，计算ZIP-active评分，采用最优ROC衍生截断值进行Kaplan-Meier生存分析和多变量Cox回归，通过GSEA进行通路富集分析，并使用CIBERSORTx估算免疫细胞分数。
研究结果
3.1 ZIP-Active上皮肿瘤细胞状态的鉴定
在患者水平上，伪批量相关分析显示SLC39A3和SLC39A4与多种癌症相关特征呈广泛正相关，包括增殖、细胞周期进程、活性氧反应、DNA修复、氧化磷酸化和糖酵解。纯化上皮肿瘤细胞重新聚类后得到12个亚群，其中簇7表现出最高的SLC39A3和SLC39A4联合表达，被指定为ZIP-active肿瘤细胞状态。比较显示ZIP-active群体中SLC39A4和SLC39A3表达显著高于其他上皮肿瘤细胞，而SLC39A2无显著差异。
3.2 ZIP-Active肿瘤细胞状态的分子特征
差异表达分析揭示ZIP-active细胞中细胞应激反应和氧化还原调控相关基因的优先表达。GSEA显示ZIP-active肿瘤细胞富集氧化磷酸化、活性氧通路、MYC靶点V1、顶面表面和NOTCH信号，而TNFα经NF-κB信号、IL6-JAK-STAT3信号、TGF-β信号等在其余上皮肿瘤细胞中优先富集。DoRothEA/VIPER分析鉴定NFE2L2（NRF2）为ZIP-active肿瘤细胞中最强烈激活的转录因子。通路评分证实簇7显著富集ROS反应、NRF2样、KEAP1-NFE2L2、铁死亡抑制、谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化特征。Slingshot分析鉴定出朝向ZIP-active簇的分化分支，沿此分支SLC39A4表达和ROS、NRF2样、OXPHOS通路评分随假时间增加。
3.3 TCGA队列中ZIP-Active转录程序的验证
ZIP-active评分与NRF2相关特征、谷胱甘肽代谢、氧化应激反应和铁死亡抑制程序呈正相关。Kaplan-Meier分析显示ZIP-active高肿瘤患者总生存期显著更差，多变量Cox分析确认ZIP-active分类与较差总生存期独立相关。GSEA显示ZIP-active高肿瘤富集活性氧、氧化磷酸化、异源物和脂肪酸代谢等通路，而免疫和炎症相关通路在ZIP-active低肿瘤中优先富集。ZIP-active高肿瘤持续表现出显著较低的T细胞相关免疫评分，CIBERSORTx分析显示CD8 T细胞和CD4记忆T细胞分数降低。
3.4 NFE2L2/KEAP1/CUL3突变状态对ZIP-Active程序生物学和临床特征的修饰作用
携带NFE2L2/KEAP1/CUL3改变的肿瘤显示显著更高的ZIP-active评分以及增加的NRF2相关、谷胱甘肽代谢、铁死亡抑制、ROS反应和OXPHOS特征。分层相关分析显示ZIP-active评分在野生型和突变型肿瘤中均与NRF2相关代谢特征保持正相关。按突变状态分层后，野生型亚组中ZIP-active高和低肿瘤间未观察到显著生存差异。野生型亚组中ZIP-active高肿瘤富集氧化应激和代谢相关通路，而免疫和炎症通路在ZIP-active低肿瘤中优先富集。T细胞相关免疫特征在野生型亚组中ZIP-active高肿瘤中降低，而在突变型肿瘤中差异较小。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次在HNSCC中鉴定出以SLC39A3和SLC39A4协调上调为特征的ZIP-active上皮肿瘤细胞状态。差异表达、通路富集、转录因子推断、通路评分和轨迹分析一致地将该状态与NRF2激活联系起来，表明协调的ZIP转运体表达识别出一种适应氧化应激的肿瘤细胞群体。值得注意的是，ZIP-active表型与EMT相关转录特征呈负相关，提示其侵袭性生物学特征可能反映NRF2相关的代谢和氧化应激适应而非经典的EMT主导表型。ZIP-active状态与铁死亡相关转录程序的密切关联支持了ZIP-active肿瘤细胞获得与增强抗氧化和脂质过氧化能力相容的转录景观的概念。ZIP-active程序与免疫冷表型的一致关联扩展了关于代谢适应影响肿瘤细胞存活和周围免疫微环境的观察。根据NFE2L2/KEAP1/CUL3突变状态的分析表明，经典NRF2通路突变增强了ZIP-active/NRF2相关表型，但不能完全解释其存在或其相关代谢特征，ZIP-active程序似乎捕获了无法被经典NRF2通路遗传激活单独解释的更广泛转录状态。
结论部分：研究人员鉴定出HNSCC中一种此前未被识别的ZIP-active上皮肿瘤细胞状态，其特征为协调的ZIP转运体表达和NRF2相关的氧化应激适应性转录程序。ZIP-active状态与氧化应激适应、免疫改变和不良预后相关，而NRF2相关代谢特征在NFE2L2/KEAP1/CUL3突变组间均与ZIP活性保持关联。这些发现表明ZIP-active状态反映了超越基因组改变本身的NRF2相关肿瘤生物学。
