《Immunity》：Targeting a site of vulnerability on circumsporozoite protein inhibits Plasmodium vivax malaria infection
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环子孢子蛋白（circumsporozoite protein, CSP）是疟原虫子孢子表面最丰富的抗原，也是已获许可的恶性疟原虫疫苗的核心免疫原成分，因此被认为是间日疟原虫疫苗研发的首选靶抗原。然而，目前对间日疟原虫CSP（Plasmodium vivax
环子孢子蛋白（circumsporozoite protein, CSP）是疟原虫子孢子表面最丰富的抗原，也是已获许可的恶性疟原虫疫苗的核心免疫原成分，因此被认为是间日疟原虫疫苗研发的首选靶抗原。然而，目前对间日疟原虫CSP（Plasmodium vivax CSP, PvCSP）上保护性B细胞表位的认识极为有限，这构成了疫苗研发的主要瓶颈。本研究通过筛选间日疟原虫感染者的抑制性血浆，鉴定出两个PvCSP B细胞表位——PvCSP-A和PvCSP-B/NAGG，分别定位于PvCSP的N端和C端区域，且不同于经典的中央重复区表位。研究人员分离获得一株单克隆抗体GRAM-4，该抗体特异性识别PvCSP-B/NAGG表位，并在体外实验中有效抑制子孢子的穿移、肝细胞入侵及肝期发育，证实PvCSP-B/NAGG是一个真正的中和靶点。研究人员进一步解析了GRAM-4与PvCSP-B/NAGG复合物2.65 ?分辨率的晶体结构，从原子水平揭示了表位识别的分子基础，为PvCSP疫苗的结构导向设计提供了蓝图。
论文解读
一、研究背景与问题
恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和间日疟原虫（Plasmodium vivax）是感染人类的两种主要疟原虫，2024年全球感染人数达2.82亿，死亡61万例，其中以5岁以下儿童为主。恶性疟原虫是撒哈拉以南非洲地区死亡的主要病因，而间日疟原虫的地理分布更为广泛。间日疟的临床病例大多源于肝内休眠形式——休眠子（hypnozoite）的复燃，这些休眠子可在初次感染后数周乃至数年重新激活，引起暴发性感染。由于现有抗疟药物清除休眠子的能力有限，且复燃感染可在临床症状出现前感染蚊媒，复燃构成了间日疟消除努力中的重大障碍。目前世界卫生组织批准的两种疟疾疫苗RTS,S/AS01和R21/Matrix-M均仅针对恶性疟原虫，其核心免疫原均基于环子孢子蛋白（circumsporozoite protein, CSP）。然而，目前尚无获批的间日疟疫苗，其研发进展明显滞后。
CSP是一种多结构域多功能蛋白，包含多聚中央重复区、N端结构域和C端结构域。间日疟原虫CSP（Plasmodium vivax CSP, PvCSP）存在VK210和VK247两种主要等位基因，其中VK210在多数流行地区占主导地位。目前关于CSP保护性表位的知识主要来源于对伯格疟原虫和恶性疟原虫的研究，普遍认为靶向中央重复区和R1/重复区连接处的抗体具有保护作用，而靶向N端和C端结构域的抗体通常不具有保护性。对于PvCSP，仅有两株单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）被表征——2F2和2E10.E9，均靶向中央重复区。自然感染或疫苗接种产生的抗PvCSP保护性抗体应答的表位靶点仍不清楚。因此，定义PvCSP上非中央重复区的保护性表位是疫苗研发的关键里程碑。
二、研究内容与主要发现
研究人员采用差异筛选策略，对51例泰国间日疟原虫感染者的血浆样本进行了子孢子入侵抑制活性筛选，并比较了抑制性血浆和非抑制性血浆对PvCSP肽阵列的反应性。通过这种方法，研究人员鉴定出两个与自然获得性抑制性体液免疫相关的表位：PvCSP-A（位于N端结构域）和PvCSP-B/NAGG（位于C端连接区前的次要重复区）。序列分析表明，PvCSP-A在PvCSP中高度保守；而NAGG重复在VK210样CSP序列中广泛存在，在VK247样序列中较少出现。MalariaGEN Pv4全球分离株数据分析显示，目前流行的间日疟原虫株CSP序列中98%含有2–8个NAGG重复。
为评估疫苗能否诱导针对这两个表位的抗体，研究人员用重组PvCSP-ecto免疫小鼠。结果显示，PvCSP-ecto免疫能够诱导针对PvCSP-A的抗体，但未能诱导针对PvCSP-B/NAGG的抗体，表明该表位在重组PvCSP抗原背景下免疫原性低下。分离获得的单克隆抗体GRAM-1（抗N端）、GRAM-2（抗中央重复区）和GRAM-3（抗C端）中，仅中央重复区特异性的GRAM-2具有抑制活性，这与恶性疟原虫CSP的中和表位认知一致。
鉴于PvCSP-B/NAGG表位在PvCSP中免疫原性低，研究人员转而使用天然含有42个串联NAGG重复的食蟹疟原虫CSP（Plasmodium cynomolgi CSP, PcCSP）进行免疫。PcCSP-ecto免疫成功诱导了能够交叉识别PvCSP-B/NAGG表位的抗体。研究人员从中分离出单克隆抗体GRAM-4，该抗体交叉识别PvCSP-ecto和PvCSP-C端结构域，精细表位定位于PvCSP-B/NAGG序列，且单个NAGG重复即可满足结合需求。
功能实验表明，GRAM-4在0.53 mg/mL浓度下有效抑制间日疟原虫子孢子对原代人肝细胞的感染，同时减少裂体期寄生虫（schizont）和休眠子（hypnozoite）的形成，效果与已知的中和抗体2F2相当。GRAM-4的抑制活性呈剂量依赖性，并能剂量依赖性地抑制子孢子的细胞穿移。此外，GRAM-4还能诱导CSP反应——即中和抗体诱导子孢子表面CSP脱落的现象，这一功能被认为是抗CSP中和抗体疫苗效力的关键特征。
结构生物学研究方面，研究人员解析了GRAM-4 Fab与4×NAGG重复肽复合物2.65 ?分辨率的晶体结构（PDB: 9YE2）。电子密度图显示4个肽残基GNAG结合在重链和轻链互补决定区（complementarity-determining region, CDR）形成的 cleft中，天冬酰胺（Asn9）侧链伸入重链/轻链界面深处的口袋，与重链Asp121和轻链Arg71形成接触。尽管GRAM-4与种系等位基因整体一致性为97.3%，重链CDRH3中的两个接触残基并非种系编码，提示这些接触通过体细胞成熟获得；而轻链接触大多为种系编码。结构分析表明，PvCSP-B/NAGG表位在完整CSP分子上具有构象灵活性，能够以线性表位形式被GRAM-4类抗体识别，且无需大量体细胞突变即可实现有效结合。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：间日疟原虫感染者血浆样本的抑制性筛选（样本来自泰国南部Ranong和Chumphon地区的51例急性症状性间日疟患者）；基于重叠15-mer肽阵列的差异表位筛选；重组蛋白表达与纯化（基于HEK293F细胞）；小鼠免疫与单记忆B细胞克隆分选（采用四聚化CSP抗原作为B细胞钓饵）；生物层干涉法（biolayer interferometry, BLI）结合分析；间日疟原虫野外分离株的体外肝期发育抑制实验（inhibition of liver-stage development assay, ILSDA）和穿移实验；X射线晶体学结构解析（使用NSLS-II 17-ID-1线站收集衍射数据）；以及基于GenBank和MalariaGEN Pv4数据库的CSP序列生物信息学分析。
四、研究结果
鉴定间日疟原虫CSP上两个来自自然感染的中和表位：通过对51例泰国感染者血浆的抑制活性筛选和肽阵列差异分析，鉴定出PvCSP-A（残基50–68）和PvCSP-B/NAGG（残基247–265）两个与抑制活性相关的表位，分别位于PvCSP的N端结构域和C端连接区前。
“NAGG”重复广泛存在于多种疟原虫CSP中：GenBank和MalariaGEN Pv4数据库分析显示，99%的VK210样CSP序列含有至少一个NAGG重复，而仅18%的VK247样序列含有该重复。全球流行株中98%的完整CSP序列含有2–8个NAGG重复。
PvCSP-ecto免疫可诱导针对所有主要CSP结构域的应答，但不针对PvCSP-B/NAGG表位：重组PvCSP-ecto免疫C57BL/6J和CD-1小鼠诱导了高滴度IgG应答，能够识别子孢子表面天然PvCSP，并针对PvCSP-N、PvCSP-r和PvCSP-C结构域产生抗体，但未检测到针对PvCSP-B/NAGG表位的抗体。
疫苗诱导的中央重复区mAb具有抑制活性，而N端和C端mAb不具有抑制活性：分离的GRAM-1（抗N端）、GRAM-2（抗重复区）和GRAM-3（抗C端）中，仅GRAM-2在0.53 mg/mL浓度下有效抑制子孢子感染原代人肝细胞，GRAM-1和GRAM-3均无显著抑制效果。
PcCSP免疫可诱导针对PvCSP-B/NAGG表位的抗体：含有42个串联NAGG重复的PcCSP-ecto免疫小鼠后，产生的抗体能够交叉识别P. vivax子孢子表面的天然PvCSP，并特异性结合PvCSP-B/NAGG表位。
GRAM-4识别PvCSP-B/NAGG表位：从PcCSP免疫小鼠中分离的mAb GRAM-4交叉结合PvCSP-ecto和PvCSP-C结构域，精细表位定位于PvCSP-B/NAGG序列，单个NAGG重复即可满足结合需求。GRAM-4仅染色表达VK210等位基因的子孢子，不染色表达VK247的子孢子。
GRAM-4抑制间日疟原虫子孢子感染：在0.53 mg/mL浓度下，GRAM-4显著减少原代人肝细胞中裂体期寄生虫和休眠子的形成，效果与2F2相当；抑制活性呈剂量依赖性（0.085–0.53 mg/mL范围）；GRAM-4剂量依赖性地抑制子孢子细胞穿移，并可诱导CSP反应。
GRAM-4识别线性核心表位序列“GNAG”：2.65 ?分辨率的晶体结构显示，GRAM-4 Fab通过重链和轻链CDR与肽配体GNAG结合，天冬酰胺9的侧链伸入重链/轻链界面深处的口袋，与重链Asp121和轻链Arg71形成关键接触。
五、讨论与结论
本研究发现，针对PvCSP-B/NAGG表位的抗体能够介导对穿移和肝细胞感染的强效抑制，验证了该表位区域作为疫苗靶点的有效性。研究还发现，自然感染中抑制性抗体的靶点并非免疫优势的中央重复区，而是两个非重复表位，这挑战了“恶性疟原虫疫苗的成功经验可直接套用于间日疟原虫”的现有范式。
PvCSP-B/NAGG表位在PvCSP中的低免疫原性可能与其低表位价数、中央重复区的免疫优势、表位不稳定或结构掩蔽等因素有关。PcCSP以42个串联NAGG重复的形式呈递该表位，成功诱导了抗NAGG抗体，表明高价位表位呈递有效激活了B细胞受体信号。而结构数据表明GRAM-4的表位仅为单个NAGG重复单元，这为设计含有较少重复但能更好诱导抗PvCSP-B/NAGG抗体的工程化免疫原提供了可能。
间日疟疫苗若能减少或消除肝期寄生虫，将对全球健康产生深远影响。复燃感染占临床间日疟病例的70%–90%，因此即使疫苗不能提供完全无菌保护，只要能减少休眠子的形成，就可能显著降低疾病传播。本研究中GRAM-4和GRAM-2均能同时减少裂体期寄生虫和休眠子的形成，提示靶向PvCSP-B/NAGG表位和中央重复表位的疫苗策略有望减少原发感染和复燃感染。该研究为间日疟疫苗开发开辟了新的途径，提出了一种靶向PvCSP不同结构域的双管齐下策略，可能比单独靶向中央重复区实现更高的疫苗效力。
研究的局限性包括：肽阵列无法呈递构象表位，筛选的抑制性样本数量有限，抗体为鼠源且每种PvCSP区域仅表征了一株代表性mAb，功能数据均为体外实验结果，仍需体内挑战模型和更广泛的抗体panel进行验证。
