《Microorganisms》：In Silico Design and Evaluation of a Multi-Epitope Vaccine Candidate Against Staphylococcus haemolyticus
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溶血葡萄球菌是一种新兴的多药耐药病原体，常引起医院感染，但目前尚无获批的疫苗可用于其预防。在本研究中，研究人员筛选了保守的表面相关蛋白，以鉴定B细胞、细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞表位，用于设计一种多表位疫苗候选物。所选表位被组装成一个包含人β-防御素-
溶血葡萄球菌是一种新兴的多药耐药病原体，常引起医院感染，但目前尚无获批的疫苗可用于其预防。在本研究中，研究人员筛选了保守的表面相关蛋白，以鉴定B细胞、细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞表位，用于设计一种多表位疫苗候选物。所选表位被组装成一个包含人β-防御素-3、PADRE序列以及选定连接子的254个氨基酸的构建体。预测结果显示，该构建体具有抗原性、非致敏性和无毒性，并具备良好的理化性质、结构稳定性和可溶性。所选的CTL和HTL表位提供了估计的97.5%全球人群覆盖率，表明其在不同人群中具有广泛的预测覆盖范围。结构分析支持了优化后三维模型的质量。分子对接预测了该疫苗构建体与TLR2和TLR4之间存在有利的相互作用，而200 ns的分子动力学模拟表明，受体-疫苗相互作用在模拟期间得以维持。密码子优化和计算机模拟克隆进一步支持了在大肠杆菌中进行重组表达的可行性。总体而言，计算分析支持所提出的多表位构建体作为抗溶血葡萄球菌的潜在疫苗候选物，并为其进一步的实验评估提供了基础。
基于反向疫苗学与免疫信息学的溶血葡萄球菌多表位疫苗计算机设计与评估
研究背景与目的
溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）是凝固酶阴性葡萄球菌中的重要机会致病菌，近年来在医院感染中的临床意义日益凸显。该病原体常见于长期住院患者、植入医疗设备者及免疫功能低下人群，可引起血流感染、导管相关感染、假体装置感染、手术部位感染、尿路感染及新生儿感染等多种疾病。溶血葡萄球菌的致病性与其形成生物膜的能力密切相关，这种结构使细菌能够抵抗不利环境条件并逃避宿主免疫清除。
目前，溶血葡萄球菌感染的临床管理面临两大挑战：一是多重耐药菌株的不断出现，包括对苯唑西林、亚胺培南、氨基糖苷类和红霉素等药物的耐药；二是生物膜的形成限制了抗菌药物的渗透和治疗效果。尽管抗菌治疗仍是重要手段，但耐药性和生物膜形成使得感染难以根除。然而，目前尚无可用的获批疫苗专门针对这一病原体。因此，研究人员采用反向疫苗学与免疫信息学相结合的计算机方法，旨在开发一种针对溶血葡萄球菌的多表位疫苗候选物。
主要技术方法
研究人员采用了完整的计算机模拟工作流程：首先从NCBI数据库获取溶血葡萄球菌完整蛋白质组，筛选表面相关蛋白；利用VaxiJen v2.1评估抗原性、AllerTOP v2.1预测致敏性、CELLO v2.5预测亚细胞定位、SignalP 6.0鉴定信号肽、TMHMM v2.0预测跨膜螺旋，并通过BLASTp排除与人蛋白质同源的候选物；随后使用BepiPred-3.0、NetMHCpan 4.1 EL和NetMHCIIpan EL v4.1分别预测线性B细胞表位、CTL表位和HTL表位，并对表位进行抗原性、致敏性、毒性和序列同源性筛选；最终将选定的表位组装成包含人β-防御素-3佐剂、PADRE肽和多种连接子的多表位构建体，并通过AlphaFold3建模、GalaxyRefine优化、ClusPro 2.0分子对接、Desmond分子动力学模拟以及JCat密码子优化和计算机模拟克隆进行综合评估。
研究结果
3.1 表面蛋白的选择与筛选
从41种初始表面相关蛋白中筛选出4种满足预设标准的蛋白：肽ABC转运体底物结合蛋白、多糖脱乙酰酶、LPXTG细胞壁锚定结构域蛋白和YSIRK型信号肽蛋白。所有四种蛋白均具有高于阈值的抗原性评分（0.5087-0.8197），被预测为非致敏性，且经Shannon熵分析显示在不同菌株间具有序列保守性。
3.2 表位的鉴定
从四种表面蛋白中共筛选出3个B细胞表位、6个CTL表位和4个HTL表位。所有选定的表位均满足抗原性、非致敏性、无毒性的标准，且未发现与人类蛋白质具有显著序列同源性。
3.3 表位保守性分析
多数选定的表位在30个同源序列中表现出高度保守性。其中，来自LPXTG细胞壁锚定结构域蛋白的两个表位在所有分析的同源物中均呈现100%保守性。
3.4 人群覆盖率评估
所选CTL和HTL表位的全球预估覆盖率为97.50%。区域覆盖率从南美洲的86.45%到欧洲的98.84%不等，其中欧洲、北美、东亚和西印度群岛的覆盖率超过98%。
3.5 疫苗构建体设计
最终疫苗构建体由254个氨基酸组成，包含N末端的人β-防御素-3佐剂、3个B细胞表位、6个CTL表位、4个HTL表位、PADRE肽和C末端的6×His标签。该构建体的VaxiJen抗原性评分为0.8609，被预测为非致敏性。
3.6 理化性质分析
该构建体分子量为27,578.17 Da，理论等电点pI为9.75，不稳定指数为22.72，脂肪族指数为64.33，亲水性平均值GRAVY为-0.665，预测溶解性得分为0.862，表明其具有良好的理化特性和可溶性。
3.7 二级结构预测
GOR4分析显示该构建体含有41.73%的α-螺旋、15.35%的延伸链和42.91%的无规卷曲。
3.8 三级结构建模与验证
经过GalaxyRefine优化后，Ramachandran图中位于最适区域的残基比例从82.6%提升至98.6%，无残基位于不允许区域。ERRAT整体质量因子为88.89，ProSA-web分析的Z评分为-3.85，表明模型质量良好。
3.9 Toll样受体对接与相互作用评估
分子对接结果显示，疫苗-TLR2复合物的加权得分为-1136.9，包含17个氢键、5个盐桥和190个非键接触；疫苗-TLR4复合物的加权得分为-1195.0，包含15个氢键、5个盐桥和210个非键接触。COCOMAPS分析进一步揭示了两类复合物界面特征的差异。
3.10 分子动力学模拟
200 ns的分子动力学模拟表明，两个受体-疫苗复合物在整个模拟过程中保持稳定。RMSD分析显示TLR4结合的系统具有更紧凑的分布；RMSF分析表明受体区域波动较小而疫苗区域显示出较高灵活性；Rg和SASA分析证实了复合物的结构稳定性；氢键分析显示模拟后期形成了更多的分子间氢键；MM-GBSA结合自由能计算显示疫苗-TLR4复合物（-255.343 kcal/mol）比疫苗-TLR2复合物（-9.050 kcal/mol）具有更有利的结合能。
3.11 计算机模拟克隆
密码子优化后，CAI从0.576提升至1.000，GC含量从57.09%降至50.79%。优化后的编码序列成功插入pET-28a（+）表达载体，证实了在大肠杆菌K12中重组表达的可行性。
讨论与结论
研究表明，整合免疫信息学方法能够从溶血葡萄球菌多个表面相关蛋白中筛选保守抗原区域，构建并评估多表位疫苗候选物。该构建体展现出良好的预测免疫学和结构特性，在全球人群中具有广泛的主要组织相容性复合体覆盖范围，并具备适合重组蛋白生产的分子特征。使用保守的表面抗原可能有助于实现对遗传多样性溶血葡萄球菌菌株的广谱保护。然而，本研究完全基于计算机分析，预测的抗原性、结构特性、受体相互作用和分子动力学行为尚未经过实验验证。未来研究应首先确认疫苗构建体的重组表达和纯化，随后进行体外免疫原性和安全性评估，继而开展动物实验评价抗体和细胞免疫应答，并通过攻毒实验确定疫苗接种是否能提供保护作用。这些实验研究对于确定该候选物的计算机预测特性能否转化为可测量的免疫应答和保护效力至关重要。
研究结论：通过整合免疫信息学方法，本研究鉴定了来自多个表面相关蛋白的保守抗原区域，构建并评估了一种针对溶血葡萄球菌的候选多表位疫苗。所得构建体展现出有利的预测免疫学和结构特性、广泛的人群HLA覆盖率以及适合重组蛋白生产的分子特征，支持其作为候选物用于进一步实验评估以对抗多重耐药溶血葡萄球菌感染。
