《Microorganisms》：Regulatory Pathways of Endophytic Fungi in Promoting Flavonoid Biosynthesis in Medicinal Plants
内生真菌通过与药用植物的长期协同进化形成了复杂的共生关系。这种跨界相互作用显著调节寄主植物中黄酮类化合物的生物合成。本综述剖析了内生真菌提高药用植物黄酮积累的机制。研究人员首先总结了内生真菌与药用植物之间的共生和促生关系，概括了四种核心协同功能：养分供给、植物激素稳态、抗逆性增强以及次生代谢激活。随后，研究人员详细阐述了内生真菌调控黄酮生物合成的三种主要调控模式，包括直接激活植物黄酮生物合成途径、通过缓解胁迫与寄主代谢重编程进行间接调控，以及内生真菌自主合成黄酮。值得注意的是，目前支持内生真菌自主合成黄酮的大多数证据来源于纯培养（axenic culture）实验，而其在被定殖植物组织内是否发生及定量贡献仍有待证实。研究人员进一步讨论了用于解析植物–真菌共生互作的前沿技术，包括多组学整合（multi-omics integration）、空间代谢组学（spatial metabolomics）、单细胞测序（single-cell sequencing）、合成微生物群落（synthetic microbial consortia）和CRISPR-Cas基因组编辑。最后，研究人员提出了涵盖药用植物绿色栽培、药用质量定向提升以及黄酮类化合物高效微生物生物合成的未来研究方向。
## 1. 引言
黄酮类化合物是药用植物中最重要的次生代谢物之一，对其药理价值具有重要贡献。这些化合物参与植物防御、逆境适应、色素沉着和信号传导，且许多黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、保肝和心脏保护活性。与其他植物次生代谢物类别（如生物碱、萜类、酚酸）相比，黄酮类化合物值得特别关注，因为它们在药用植物类群中分布广泛，与植物生态适应性和疗效密切相关，且其生物合成途径已相对清楚。因此，理解黄酮生物合成与积累的调控方式，对于提高药用植物的质量、功效和可持续生产具有重要意义。
药用植物与内生真菌形成的关系代表了自然界中一种高度协同的生物互作形式。它深刻调控寄主植物的生长、健康和逆境适应，以及核心生物活性化合物的生物合成与积累。通过与药用植物的长期协同进化，内生真菌建立了广泛而复杂的共生关系，这一关系被生动描述为“秘密联姻”。内生真菌与寄主植物形成紧密且通常互利的联系，影响寄主生长、逆境适应和次生代谢。黄酮生物合成受植物遗传背景、发育阶段、组织类型和环境条件控制，同时也受植物相关微生物尤其是内生真菌的强烈影响。这种共生关系远超简单的寄主–共生体关联，构成一个以动态持续化学信号对话为特征的功能单元。这种互作深刻影响寄主的生理生态和抗逆性，尤其是生物活性次生代谢物的合成与积累，是连接植物基因型与药用表型的关键桥梁。
越来越多的证据表明，内生真菌可通过多种相互关联的机制调控药用植物的黄酮代谢。一些内生真菌通过产生植物激素、溶解磷、固定氮或提高对干旱、盐碱等非生物胁迫的耐受性来促进寄主生长和养分获取。在增强抗病性方面，它们可通过与病原菌竞争生态位和营养、产生抗微生物代谢物或系统激活植物免疫防御系统来保护寄主。这些生理变化通常伴随着次生代谢的变化。特别是，真菌来源的诱导子（elicitors）和信号分子可激活植物信号转导途径，改变转录调控，上调黄酮生物合成的关键基因，包括苯丙烷和黄酮途径中编码酶的基因。通过这些过程，内生真菌可能增加特定黄酮的积累，从而提高寄主植物的药用质量。
内生真菌调控黄酮生物合成的研究已从简单的分离、培养和代谢物筛选走向整合机制分析。宏基因组学和扩增子测序有助于表征与药用植物相关的内生真菌群落。转录组学和蛋白质组学揭示真菌定殖或诱导后寄主基因表达和蛋白质丰度的变化。代谢组学进一步鉴定黄酮谱和相关代谢途径的变化。这些方法结合使用时，提供了系统层面的理解。空间代谢组学还为可视化植物–真菌界面中黄酮和其他代谢物的分布提供了新机会。目前关于内生真菌调控黄酮代谢的研究涵盖多种证据水平，从相关性表型和组学关联、途径级信号响应、功能调控事件和代谢通量重分布，到明确的因果验证。
因此，内生真菌与药用植物之间的互作应被视为黄酮生物合成的重要调控因子，而不仅仅是一种普遍共生现象。阐明内生真菌调控黄酮代谢的机制可为提高药用植物质量提供理论支持，也为开发微生物肥料、生物刺激素、生防制剂和可持续栽培策略提供实践指导。许多已有综述分别总结了内生真菌–药用植物共生关系、真菌诱导子触发的植物次生代谢、黄酮生物合成途径以及菌根共生引起的代谢变化。然而，这些文献倾向于聚焦植物–微生物互作的单一层面，很少提供涵盖寄主定向代谢响应、胁迫相关代谢重编程和真菌来源代谢物产生的整合性综合。因此，本综述旨在综合当前分散的研究发现，并区分已发表研究中不同的实验支持程度，总结未解决的挑战以指导未来的机制和转化研究。
文献检索在PubMed、Web of Science和Scopus中进行，最终检索完成于2026年5月。关键词包括“内生真菌”“药用植物”“黄酮类”“苯丙烷”“生物合成”和“调控”，根据各数据库语法单独或组合使用。检索主要覆盖2010至2026年的文献，并纳入部分早期里程碑式研究作为历史背景。纳入标准为涉及内生真菌相关黄酮产生、代谢调控、寄主–微生物互作或药用植物机制方面的同行评审原创文章和综述。会议摘要、学位论文、重复记录和相关性有限的研究被排除。
## 2. 内生真菌与药用植物的共生及促生关系
### 2.1. 内生真菌与药用植物的共生关系
内生真菌通过自然开口（包括气孔、侧根裂隙和伤口位点）定殖药用植物组织。药用植物质膜受体识别真菌几丁质片段和寡糖诱导子，触发瞬时活性氧爆发和细胞质Ca
2+内流，激活基础免疫反应。与病原感染不同，相容性内生真菌抑制寄主PAMP触发的免疫（PTI），并诱导共生相关基因（如CASTOR和POLLUX）的表达。需要指出的是，这些分子事件并非在所有非菌根药用植物内生真菌中广泛保守。在这些模式共生系统中，免疫减弱将真菌菌丝限制在表皮和皮层细胞间隙，并阻止其大量侵入维管束。关键的是，组织定殖仅反映内生栖息状态而非专性互惠：互作状态可在中性、促生或弱致病模式之间转换，受寄主基因型、真菌菌株和环境背景调节。
内生真菌可从土壤、空气或邻近植物水平获得，但有些真菌通过种子传播，从亲代植物垂直传递给后代。垂直传播可能促进植物–真菌关联的稳定遗传和早期建立，在多年生药用植物或反复遭受环境胁迫的植物中尤为重要。然而，垂直传播的真菌并非在所有条件下都有益，其对寄主生长、防御和黄酮代谢的影响仍取决于寄主遗传背景、组织特异性、真菌丰度、植物发育阶段和环境背景。
内生真菌通常以深色隔膜内生真菌（DSE）菌丝形式定殖寄主根系内部组织，同时在兰科植物中呈现典型的兰花菌根模式。在叶片内，真菌主要产生沿细胞壁生长的无色营养菌丝，偶尔产生厚垣孢子。此外，植物叶片也 harbors 多样的内生真菌群落。内生真菌的定殖群体通常远小于植物组织体积，但可系统性地影响寄主基因表达。例如，在早期定殖阶段，内生真菌Metarhizium anisopliae通过激活吲哚-3-乙酸（IAA）生物合成途径中的关键基因与其寄主建立共生关系，从而对寄主生理过程产生系统效应，例如促进黄酮合成。
化学信号对话控制药用植物系统中寄主–真菌相容性和定殖强度。内生真菌分泌小分子信号代谢物，而药用植物则释放黄酮类、独脚金内酯和茉莉酸作为反馈信号。典型例子是Serendipita indica重排细胞内生长素转运和分布，以重新平衡寄主细胞内源激素串扰。这种化学通讯共同增强植物对干旱、盐碱和重金属胁迫的耐受性。胁迫缓解减少了基础抗氧化防御的不必要代谢消耗，并将代谢通量转向药用价值高的黄酮化合物的合成。药用植物–内生真菌共生协同进化的“低侵入性、强信号串扰”特征，为真菌介导的黄酮生物合成调控奠定了坚实的生理基础。
### 2.2. 内生真菌与药用植物的促生关系
促生共生是植物–内生真菌互作中应用价值最高的类型。内生真菌能显著提高药用植物的生物量、根系活力、生物活性成分积累和栽培适应性。相关机制主要涉及养分调节、植物激素调控、抗逆性增强和次生代谢诱导。这类促生效应已在组织培养、盆栽试验和田间试验中得到广泛验证。常用研究方法包括多组学技术（转录组学、代谢组学、16S和ITS测序）和同位素示踪分析。
#### 2.2.1. 养分获取与吸收
内生真菌分泌草酸、柠檬酸和磷酸酶，将不溶性土壤磷和钾转化为可利用形态，优化寄主矿物质供应。代表性菌株包括Aspergillus niger、Penicillium spp.和Trichoderma spp.，它们改善根系构型并提高养分吸收能力，而Piriformospora indica促进氮、磷、钾的吸收以增强寄主生物量积累。Phomopsis liquidambaris B3提高根系IAA和ABA水平，增加土壤铵态氮，增强植物氮储存。内生菌还能动员不溶性铁以支持寄主生理活动。改善的矿物质营养为提高碳通量向苯丙烷途径流动奠定了物质基础，这是药用植物黄酮生物合成升高的前提。
#### 2.2.2. 激素生长调节
内生真菌合成IAA、赤霉素（GAs）、玉米素核苷（ZR）和ABA等植物激素，直接促进细胞分裂和伸长。从Oxalis corniculata分离的内生真菌如Aspergillus fumigatus TS1和Fusarium proliferatum BRL1产生大量IAA和赤霉素。菌根共生通过养分交换重塑内源激素网络，介导ABA、生长素、SA和JA信号级联，以改变抗氧化能力和养分运输。细胞分裂素和生长素协调控制真菌定殖；SA和JA共同平衡共生与胁迫响应以增强寄主适应性。特定真菌代谢物（如Ceratobasidium GS2分泌的甾醇）调控药用兰科植物的种子萌发和器官发育。关键的是，这些真菌来源的激素信号作为上游调控开关，激活驱动黄酮结构基因表达的转录因子。
#### 2.2.3. 抗逆性与防御激活
作为天然诱导子，内生真菌释放细胞壁β-葡聚糖和几丁质寡糖，触发SA/JA依赖性系统抗性并减少病原菌病斑。同时，内生真菌定殖显著增强寄主抗氧化酶活性，促进非酶抗氧化剂积累，从而减轻干旱、盐碱、高温和重金属胁迫下的氧化损伤。作为重要的共生调节因子，内生真菌通过渗透调节、离子平衡和植物激素调节的协调作用，维持药用植物在干旱、盐碱、高温和重金属胁迫下的正常光合作用、养分吸收和稳健生长。稳定的生理稳态提供足够的碳骨架以支持持续的黄酮生物合成。重要的是，内生真菌触发的胁迫诱导抗氧化反应显著将寄主代谢通量转向苯丙烷途径，这是黄酮生物合成的核心上游路径。
内生真菌分泌的代谢物（如胞外聚合物EPS）进一步作为非接触型生物刺激素发挥作用。EPS显著提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，PAL是黄酮合成的限速酶，从而直接促进药用植物黄酮积累。总体而言，内生真菌激活的胁迫防御反应不仅改善植物逆境适应性，这种防御 priming 还是重编程次生代谢的关键上游信号，在正常和胁迫条件下均显著促进药用植物黄酮过量积累。
#### 2.2.4. 次生代谢与品质提升
内生真菌定殖重塑寄主次生代谢，黄酮积累是最具代表性的功能表型。大量药用植物案例证实，内生真菌接种显著提高总黄酮含量；例如，Trichoderma atroviride D16显著提高丹参中酚类和黄酮产量。除诱导植物内源黄酮合成外，内生真菌自身也产生黄酮衍生物作为活性诱导子。真菌乙酰化黄酮与寄主代谢物协同增强整体抗氧化和药用活性，在共生系统中形成双黄酮来源。综上所述，内生真菌介导的养分供应、激素调节和胁迫 priming 的共同作用汇聚于促进药用植物黄酮富集。这种微生物诱导策略降低化肥和农药依赖，支持生态友好型栽培和稳定的药材质量。
## 3. 药用植物中的主要黄酮类化合物及其作用
黄酮类化合物是广泛分布于药用植物中的重要次生代谢物类别，其特征是共同的C6–C3–C6骨架。根据中央C6–C3–C6骨架的氧化状态和取代模式差异，黄酮类化合物通常被分为黄烷醇、黄烷酮、黄酮、异黄酮和双黄酮等亚类。在药用植物中，黄酮类化合物通常以糖苷形式存在，而非仅为游离苷元。糖基化涉及糖部分与黄酮骨架的结合，可显著影响化合物的溶解度、稳定性、细胞运输、组织分布、代谢和生物活性。
不同植物种类积累不同且比例各异的黄酮成分，从而赋予其多样且互补的药理特征。常见药用植物中不同类型黄酮各发挥关键作用。例如，槲皮素和山奈酚是常见的黄酮化合物，广泛存在于药用植物中，与芦丁一起发挥强抗氧化作用。以表儿茶素为代表的黄烷醇是茶多酚的主要成分，累积证据表明其具有抗氧化、抗癌、心脏保护、抗菌、抗病毒和神经保护等多种健康有益生物活性。黄酮（如芹菜素）和黄烷酮（如柚皮苷）也在多种药用植物中具有显著的抗炎和血管保护作用。特别值得关注的是银杏叶中的生物活性成分，富含包括银杏内酯在内的双黄酮类。由于其对神经系统的多靶点调节作用，这些化合物在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的干预中展现出突出潜力。另一重要亚类是黄酮木脂素，以水飞蓟中的水飞蓟宾为代表，由黄酮和苯丙烷单元缩合形成，具有保肝作用。
这些黄酮生物活性的分子机制已被逐步阐明。核心途径之一是激活细胞内NRF2信号级联，NRF2是细胞抗氧化反应的主调控因子。该级联触发多种解毒酶和抗氧化蛋白的表达，使细胞能够抵抗氧化应激诱导的损伤。此外，这些黄酮能有效抑制多个核心促炎信号通路，如TLR和NF-κB，同时下调环氧合酶-2（COX-2）等炎症介质的活性，从而发挥强效广谱抗炎作用。在心血管系统中，特定黄酮能够扩张冠状动脉、增加冠脉血流并降低血管脆性，为其在高血压、冠心病和心绞痛防治中的应用奠定了理论基础。此外，这些黄酮的抗菌和抗病毒活性与其干扰微生物生命活动的能力密切相关。需要注意，许多已报道的药理效应是利用纯化合物、黄酮富集组分或粗提物证实的，而非通过内生真菌特异性调控黄酮谱的植物材料证实。
## 4. 内生真菌对寄主植物及黄酮合成调控的影响
植物与内生真菌通过长期协同进化形成了复杂的互作网络。药用植物黄酮积累受多种寄主和环境因素调控，内生真菌可能通过若干直接或间接途径参与这一过程。高通量测序已被用于表征苦荞的内生真菌多样性，并筛选可能改善黄酮积累和植物生长的真菌菌株。在一项研究中，Bipolaris、Hymenula和Colletotrichum等真菌属的相对丰度与芦丁和槲皮素等主要黄酮的浓度呈正相关。这些发现提示真菌群落与黄酮积累之间可能存在生态或功能关联，但并不能证明这些真菌属直接调控黄酮生物合成。观察到的相关性也可能反映寄主基因型、组织化学、植物发育阶段或环境条件对真菌群落组成和黄酮积累的共同影响。反之，黄酮或其他寄主代谢物可能影响真菌的募集、定殖或相对丰度。因此，已报道的关系应被视为相关性证据而非实验证明的因果关系。直接调控效应将需要额外证据，如受控接种实验、真菌菌株特异性定殖分析、真菌丰度和寄主响应的时间测量、真菌突变体、纯化真菌诱导子、寄主基因扰动，或同位素示踪和代谢通量分析。
在此基础上，内生真菌与黄酮代谢之间的潜在互作更适合表示为一种相互关联的网络，涉及可能的寄主途径响应、真菌来源代谢物以及寄主生长或胁迫环境的变化。这些过程可能重叠，但其相对贡献和因果关系在大多数药用植物系统中仍有待确定。
### 4.1. 生物诱导与植物代谢途径的激活
这是最基本且最广泛的机制。作为高效生物诱导子，内生真菌在寄主植物中触发轻度生物胁迫，激活寄主防御信号网络，并进一步诱导黄酮生物合成等次生代谢途径。JA和SA信号通路对此过程有重要贡献。例如，甘草（Glycyrrhiza glabra L.）是富含黄酮的药用植物，其黄酮合成受茉莉酸相关激素调节。茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨羟肟酸（SHAM）对黄酮生物合成的差异调节作用表现为：MeJA通过激活JA信号通路和下游MYB/bHLH转录因子促进黄酮合成，而SHAM抑制该途径。在更特异的共生关系中，如丛枝菌根真菌（AMF）与寄主植物的互惠共生，这些真菌可触发寄主细胞广泛代谢重编程。AMF以此改善远志的药用特性并促进黄酮等代谢物积累。激素信号也表现出明显的串扰。例如，茉莉酸酯水平升高可同时促进西洋参形成层干细胞中人参皂苷和黄酮的合成。菌根真菌为理解真菌对黄酮代谢的影响提供了重要比较背景，但应与非菌根内生真菌区分。
在分子水平上，这种激活更加精准。当Botryosphaeria dothidea J46侵染干旱胁迫下的荞麦时，其特异性上调寄主苯丙烷生物合成途径中编码关键酶的基因，包括肉桂酸4-羟化酶（C4H）、查尔酮合酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI），进一步增强黄酮生物合成以帮助寄主应对干旱胁迫。相比之下，Irpex lacteus J79通过提高光合基因表达间接促进黄酮合成，增加能量供应和L-苯丙氨酸前体积累。这两种菌株通过不同调控途径协同增强寄主抗旱性。一个例子说明真菌分泌蛋白可能介导真菌–寄主蛋白互作：真菌PgSCP蛋白与柑橘转录因子互作并激活PR1样防御基因。这一发现为内生真菌–寄主串扰中的信号转导提供了合理类比。然而，该研究并未提供将PgSCP与黄酮生物合成基因表达或黄酮代谢物水平变化直接联系的实验证据。这种特异性直接互作揭示了真菌精确调控植物防御相关代谢网络（尤其是黄酮生物合成）的新机制。
### 4.2. 环境胁迫缓冲与随后的代谢重编程
真菌还对寄主代谢途径和代谢通量产生深远的间接影响。它们增强寄主抗逆性，这被称为环境缓冲效应。黄酮发挥抑制病原菌和缓解植物病害症状的生物活性功能，且已被证明与植物抗氧化活性正相关。内生真菌重塑植物微生物群落并抑制病原真菌定殖，从而提高植物胁迫耐受性并重新平衡初级与次生代谢之间的资源分配。根内生真菌Piriformospora indica可激活苯丙烷途径，进一步促进黄酮和黄烷醇的合成，改善大豆生长、养分吸收和非生物胁迫耐受性。内生真菌对黄酮产生的影响依赖于环境背景，并受生长–防御权衡支配。当内生真菌触发轻度胁迫响应时，苯丙烷和黄酮生物合成可增强以发挥抗氧化和防御作用。在其他情况下，内生真菌减轻寄主氧化胁迫，随着抗氧化需求降低，寄主可能减少黄酮合成并将碳资源重新分配以支持营养生长。生长–防御权衡的结果也受碳源可用性制约：当光合产物和可溶性糖充足时，植物可同时维持生长和黄酮生物合成；而当碳限制时，碳骨架转向防御相关次生代谢可能产生更明显的生长代价。最终结果取决于几个交互变量：胁迫强度、碳可用性、植物发育阶段和定殖真菌的生活方式。
在干旱胁迫下，有益真菌缓解植物生理损伤，诱导脯氨酸积累，增加超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性，并维持根系发育和光合性能。内生真菌作为植物代谢网络的重编程者，不仅调节单一途径，而是全面调节包括黄酮代谢在内的多个途径的通量。类似地，AMF通过不饱和脂肪酸、二萜和黄酮途径重编程远志根系代谢。真菌缓解植物氧化胁迫后，植物减少抗氧化黄酮的大量合成，进一步改变寄主整体代谢优先级。这一过程反映了资源竞争。Paraphoma chrysanthemicola影响党参碳水化合物代谢并抑制SA信号，从而重塑初级与次生代谢之间的权衡。这种代谢权衡可见于Aspergillus terreus合成大黄素甲醚（大黄素衍生物）的过程中，生物合成效率与细胞适应性之间存在平衡。解毒相关P450酶缺失提高大黄素甲醚产量，但削弱真菌菌株的稳健性。
真菌缓解氧化胁迫后，植物减少抗氧化黄酮的过量产生，从而将代谢资源转向生长，反映了抗逆与生长之间的资源权衡。或者，内生真菌帮助植物获取足够资源，使植物能产生更多样化的防御化合物（包括黄酮）。内生真菌可产生大量防御性生物活性化合物，尤其是抗氧化剂。从非洲石松中分离的内生菌Phoma sp. SK5的代谢物可清除DPPH、ABTS和H
2O
2等多种自由基，表现出强抗氧化能力。这表明在共生系统中，真菌的这些能力可增强植物整体防御机制，使其能够应对更广泛的胁迫。这种缓冲效应使黄酮合成在植物–真菌共生体在不同环境下保持稳定性和可塑性。
### 4.3. 内生真菌对黄酮生物合成的内在贡献
传统研究将黄酮视为典型植物代谢物。然而，近期突破性研究表明，一些真菌可通过新途径独立合成黄酮。这一发现极大更新了人们对黄酮起源和进化的理解。值得注意的是，这些真菌进化出独特的黄酮生物合成酶系统，与植物完全不同。最显著的发现来自植物相关真菌Pestalotiopsis fici。研究人员在该真菌中鉴定到一种名为FnsA的NRPS-PKS杂合酶。该酶以游离的对香豆酸或对羟基苯甲酸为直接底物，催化柚皮素（关键黄酮前体）的合成。这一途径完全跳过了植物黄酮合成中的两个关键步骤，避免了香豆酰辅酶A（必需的底物活化）的形成和CHS催化的缩合反应，因此代表了一种全新的黄酮生物合成途径。这不仅是对黄酮生物合成途径认识的重要补充，也证明了自然界代谢途径的趋同进化和多样性。
进一步研究证实这不是孤立案例。在Aspergillus luminescens中，已鉴定到一个负责合成氯代黄酮的完整基因簇。该簇包含CfoA（负责构建查尔酮骨架的NRPS-PKS杂合酶）、CfoK（具有新型催化机制的查尔酮异构酶）和CfoJ（一种新型黄酮合酶）。这些真菌酶在序列和催化方式上与植物同源酶存在明显差异，构建了一条完全独立于植物的黄酮生物合成途径。目前，几乎所有黄酮微生物细胞工厂都是通过异源工程化植物途径构建的。这些发现具有重要理论意义，可将新型酶应用于微生物细胞工厂，促进高价值黄酮的高效合成，并提供有前景的技术前景。
综上所述，内生真菌通过多层次、多机制的协同网络调控植物黄酮生物合成。Colletotrichum和Bipolaris属中的某些菌株说明了内生真菌的功能可塑性：这些属中的特定菌株在特定条件下可表现为病原菌，而其他菌株可自主合成黄酮或触发寄主黄酮积累。重要的是，这些性状具有菌株特异性和背景依赖性。属水平证据不能支持单一菌株同时具备所有这些功能。激活、内源合成和环境缓冲在共生中紧密交织而非单独运作，它们维持动态平衡并共同决定寄主植物的黄酮代谢。大多数支持这种生物合成能力的证据来自纯培养真菌实验。必须区分三种独立情景：真菌在纯培养中产生黄酮、真菌在定殖寄主植物组织时合成黄酮、以及真菌黄酮对药用植物总黄酮库的定量显著贡献。纯培养获得的证据证实了这些真菌的内在生物合成潜力，但不能证明黄酮合成在内生定殖期间发生，也不能证明真菌来源黄酮构成寄主植物中检测到的总黄酮的有意义部分。尽管这些生物合成基因簇（BGCs）对开发微生物细胞工厂很有前景，但仍需直接的植物内证据来评估共生条件下真菌对植物黄酮库的贡献。
## 5. 研究内生真菌与药用植物互作的新技术
内生真菌与药用植物互作研究已成为生物技术和药学科学的研究热点。当前研究主要聚焦于内生真菌在寄主植物中产生的生物活性代谢物及其对药用植物的促生效应。近年来，得益于高通量测序、高分辨率成像、人工智能和计算生物学的快速发展，药用植物与内生真菌互作的机制研究已超越传统的分离、培养和化学分析，进入多维度和系统分析的新时代。该领域正经历根本性范式转变，研究重点从传统分离鉴定转向多维度、跨尺度和工程化探索。新兴技术的综合应用加深了对这一复杂共生系统的洞察，并高效连接基础研究与产业转化。这些先进技术揭示了共生背后的复杂分子互作，同时为精准调控药用植物生物活性成分生物合成和探索创新微生物资源提供了有力工具。
### 5.1. 多组学整合
多组学整合能够系统和定量地解析植物–真菌共生的核心调控机制，包括生物诱导、环境代谢缓冲和真菌内源黄酮生物合成。传统内生真菌研究多集中于真菌分离、培养和代谢物生物活性筛选，但不能反映寄主与内生真菌之间的动态互作机制。多组学整合现已成为解开这一互作网络的核心工具。通过整合宏基因组学、转录组学和代谢组学等多维数据，可系统揭示内生真菌如何影响药用植物的基因表达、代谢物合成和胁迫响应。例如，一项针对苍术的研究鉴定出Paraphoma sp.和Paraburkholderia aromaticivorans为促生效果最强的内生真菌和细菌，利用多组学技术结合表型分析，系统阐明了这两种生物调控苍术的独特机制。
多组学分析可揭示真菌定殖、寄主转录变化和黄酮积累之间的相关性。然而，相关性多组学数据本身不能确证因果调控机制。因果验证需要靶向功能实验，如构建真菌突变体、寄主基因敲除或敲低、遗传互补分析、纯化真菌诱导子处理、同位素标记前体示踪、无菌或限菌培养系统以及时间分辨动态实验。这些方法有助于区分偶然关联与真实调控。空间代谢组学的进展使完整组织分析成为可能，该技术直接可视化药用植物组织（根、茎、叶）与其内生真菌之间代谢物的空间分布和转运，为解读寄主–微生物共生中的代谢串扰提供了前所未有的视角。空间代谢组学仍面临关键瓶颈：空间分辨率与检测灵敏度难以平衡。高空间分辨率通常伴随代谢物覆盖度降低，且该技术在原位鉴定微量真菌代谢物方面受限。此外，代谢物产生与检测之间的时间滞后可能导致动态信息丢失。未来可整合同位素标记或活细胞成像以实现实时追踪。内生真菌并非对寄主整体代谢系统产生均匀影响，而是通过特定信号分子在不同器官（根、茎、叶）或同一器官不同区域诱导不同代谢谱。空间代谢组学通过表征药用植物部位间代谢和微生物组的空间特异性，在探索植物–微生物互作中发挥关键作用。
高通量测序结合多组学整合分析已成为解析植物–微生物互作机制的核心方法。宏基因组学绕过微生物培养，直接测序植物组织中的总真菌DNA，全面表征内生真菌群落的物种组成和功能基因库。但它存在物种分辨率有限、功能基因注释不确定和时空动态信息不足等局限。在此基础上，转录组学与代谢组学的整合应用，即转录组–代谢组关联分析，可将真菌和寄主植物中的基因表达变化与关键活性成分（如多糖、黄酮、生物碱）的积累动态直接联系，并精确鉴定其互作的关键代谢途径和调控节点。例如，比较转录组和代谢组联合分析揭示了内生真菌Pestalotiopsis sp. DO14促进铁皮石斛多糖和黄酮积累的分子机制。此外，蛋白质组学和蛋白质–蛋白质互作组学可鉴定在互作界面直接发挥作用的效应蛋白和信号分子，为解析共生建立提供直接证据。
### 5.2. 单细胞与高分辨率成像技术
单细胞测序和高分辨率成像有效解析真菌生物诱导中的细胞异质性。这些技术捕捉常规群体分析中掩盖的细胞特异性信号感知和黄酮调控响应。为在更精细尺度观察互作过程，单细胞和高分辨率成像技术取得突破。单细胞RNA测序（scRNA-seq）区分不同寄主植物细胞类型（如表皮细胞、维管束细胞）对真菌定殖的特异性转录响应，从而揭示植物–内生真菌互作的空间异质性。植物细胞具有厚细胞壁和紧密的细胞间连接，使得原生质体分离相当困难。同时，真菌RNA在植物细胞中仅占极小比例，极大挑战数据解读的灵敏度和准确性。相比之下，共聚焦显微镜等先进成像方法允许非侵入性活体观察，可可视化和量化植物组织内真菌菌丝的三维分布和定殖模式。这些技术将分子机制与细胞和组织学表型紧密联系，实现从宏观到微观尺度的全面观察。
### 5.3. 合成生物学与基因编辑
合成生物学和基于CRISPR的基因编辑技术为验证和优化上述三种调控模式提供了靶向遗传工具，尤其是能够实现负责内源黄酮合成的真菌沉默BGC的功能验证，并优化真菌诱导调控效率。在遗传水平上，合成生物学和基因编辑作为有力工具，支持对内生真菌代谢潜力的靶向挖掘和改造。基于CRISPR-Cas系统的生物合成基因簇（BGC）编辑使研究人员能够精确操作内生真菌中控制特定生物活性化合物（包括聚酮、萜类和meroditerpenoids）生物合成的靶基因簇。这些精确操作包括敲除、激活和异源重构，进一步阐明生物合成途径并产生新衍生物。
典型例子是应用体外CRISPR-Cas9核糖核蛋白编辑敲除Aspergillus wentii中的全局负调控因子mcrA，从而唤醒多个沉默聚酮BGC并促进17种次生代谢物的生物合成。进一步双敲除优势PKS基因gedC消除了丰富的大黄素衍生物，暴露出一种未描述代谢物（命名为aspergillus acid E）以及已知的aspergillus acid B。该策略不仅加速药物先导化合物发现，还使高价值代谢物在工程菌株中异源表达和建立可持续生物生产平台成为可能。
在大规模数据集的推动下，生物信息学和合成生物学支持植物–内生真菌互作系统的合理设计和调控。宏基因组和转录组数据的生物信息学挖掘可预测内生真菌中的隐蔽BGC，揭示其产生新天然产物的能力。在此背景下，合成微生物群落（SynComs）技术作为强大研究前沿应运而生。SynComs通过人工组装功能性内生真菌联合体，在可控条件下实现真菌诱导黄酮促进和环境缓冲效应的标准化优化，进一步升级调控系统。通过组装具有促生和代谢诱导等特定功能的多株内生真菌可构建人工共生系统。将这些合成菌群接种到药用植物后，可系统评估其提高药材产量和质量的能力。这将研究范式从描述自然共生推进到合理设计功能性共生。
当前SynComs设计多依赖简化的二元或三元互作，难以重现自然生态位中多物种间的复杂竞争和合作关系。此外，实验室条件与田间环境差异巨大，常导致合成微生物群落移植后定殖失败或功能衰减。未来应在更接近自然生态动态的条件下优化SynComs的组成和稳定性。同时，可利用合成生物学策略工程化内生真菌代谢途径，实现高价值植物来源药物前体的高效生产。
多组学整合、单细胞分析、高分辨率成像和合成生物学等新兴技术极大推进了内生真菌与药用植物互作研究。这些技术体系相互补充和验证：多组学阐明分子途径，单细胞成像解析空间和细胞异质性，基因编辑实现三种核心调控机制的功能验证和产业转化。这些成果加深了对植物–内生真菌共生的机制理解，并促进了创新策略的开发。它们能够通过微生物组工程实现药用植物靶向品质改良，并促进新型内生真菌功能的可持续发现。
## 6. 挑战与未来趋势
### 6.1. 挑战
目前对内生真菌介导药用植物黄酮调控的理解主要建立在相关性分子和生理观察之上，但主要方法论和概念局限仍限制着机制的确定性和现有发现的实践转化。现有研究高度依赖多组学分析、群落关联分析和表型检测，这些方法通常捕获统计共变而非因果调控关系。涉及“调控”“激活”“代谢重编程”等功能性术语的解释往往在缺乏严格遗传学、生物化学或功能验证的情况下被泛化。缺乏标准化验证体系——包括真菌遗传修饰、寄主基因扰动、遗传互补、纯化诱导子处理、同位素示踪和限菌培养——导致关联数据的过度解释普遍存在，削弱了当前黄酮调控模型的可靠性。
植物–真菌共生固有的功能可塑性进一步复杂化了黄酮代谢的可预测操控。内生真菌处于动态的内生菌–病原菌连续谱上，在受控实验室条件下观察到的有益代谢表型并非组成型或稳定的。寄主遗传背景、发育状态、土壤养分可用性、环境胁迫强度、温度波动和真菌定殖密度共同重塑共生结果。真菌在植物组织内过度增殖可破坏细胞稳态，触发强烈免疫反应，并损害植物生长和次生代谢，导致田间条件下黄酮促进效应丧失甚至病原性损伤。这种背景依赖的功能不稳定性为菌株筛选和大规模农业应用带来了巨大不确定性。
在转化研究中，药用植物品质评价体系仍过于简化。黄酮浓度常被用作药用价值改善的唯一指标，忽略了次生代谢物富集与植物整体生产力之间的关键权衡。组织黄酮浓度升高并不等同于单株总代谢物产量提高，因为真菌诱导次生代谢往往抑制营养生物量积累。代谢谱变化、药理生物活性和批次间一致性进一步决定实际药用质量，而这些在当前内生真菌研究中很少被系统评估。
模式微生物和植物系统中可用的先进分子技术在药用植物–内生真菌研究中仍未得到充分利用。尽管单细胞分辨率测序和CRISPR基因组编辑为解决细胞特异性代谢调控和验证真菌生物合成基因簇提供了有力工具，但大多数相关应用仍停留在概念层面，尚未在天然药用植物共生系统中得到实证验证。
### 6.2. 未来趋势
内生真菌调控黄酮代谢的未来研究应优先建立因果和机制严谨的框架，取代当前文献中占主导地位的相关性解释。系统性功能验证策略，包括靶向真菌诱变、寄主基因敲低、代谢物示踪和无菌限菌培养系统，将能够清晰区分统计关联与真实调控因果。涵盖转录组学、生物化学、代谢组学和直接微生物生物合成证据的证据强度标准化分级，将提高未来综合研究中机制总结的客观性和可重复性。
应更加重视解析内生真菌功能的背景依赖性可塑性。在不同寄主基因型、发育阶段、环境条件和定殖强度下进行综合评估，将有助于定义稳定的有益共生阈值。对内生菌–病原菌连续谱的明确考虑将防止实验室来源有益表型的过度概括，并提高筛选微生物资源田间应用的可靠性。
评估内生真菌诱导的药用品质改善需要多维评价体系。未来转化研究需综合整合黄酮浓度、总代谢物产量、植物生物量、次生代谢谱、药理活性和生产稳定性。生长–防御权衡的平衡评估将支持对接种效应进行更科学和实用的评价。
一个重要未来方向是应用人工智能和机器学习解码复杂多组学数据集。转录组学、蛋白质组学、代谢组学、表观基因组学、微生物组分析和空间代谢组学产生高维数据，难以仅用传统基于相关性的方法解释。机器学习模型可用于识别关键调控节点、预测基因–代谢物关联、推断转录因子–靶标关系，并优先筛选候选真菌诱导子或植物受体进行功能验证。基于网络的学习、图神经网络、随机森林模型、贝叶斯推断
