芽孢杆菌单菌及联合接种对延迟移栽草莓穴盘苗的生长促进作用

《Microorganisms》：Growth Promotion of Delayed-Transplanted Strawberry Plug Seedlings by Single- and Combined-Strain Inoculation of Bacillus spp.

　　

摘要：延迟移栽穴盘苗常导致根系卷曲和生长迟缓，影响草莓（Fragaria × ananassa）移栽质量及商业育苗表现。尽管植物生长促进细菌（PGPB）被广泛用于增强作物生长与抗逆性，但其对延迟移栽草莓的影响尚不明确。本研究探究了两种芽孢杆菌（Bacillus）菌株（KP3P9和K13C）单独及联合处理对12周龄‘红颜’草莓穴盘苗（已延迟移栽约5–8周）生长及根系构型的影响，并通过根系代谢组学分析揭示与芽孢杆菌接种相关的代谢重编程。结果表明，所有芽孢杆菌处理均促进了延迟移栽草莓植株的生长，提高了鲜重并改善了根系发育。代谢组学分析显示，所有芽孢杆菌处理均增加了根系中的甾体类物质含量，但降低了黄酮类、酮/醛/酯类、木脂素、核苷酸、苯丙素类和糖类的水平。此外，不同处理间呈现出独特的代谢特征：单独KP3P9/K13C处理提升了多酚和萜类物质；K13C特异性地增加了醇类、生物碱和香豆素；而二者联合施用（KK）则特异性增强了氨基酸积累。KEGG富集分析进一步揭示了差异化的代谢重编程：KP3P9显著富集了泛酸和辅酶A生物合成、角质化包膜形成及氨酰tRNA生物合成通路；K13C富集了酪氨酸代谢和α-亚麻酸（ALA）代谢通路；而KK则特异性富集了黄酮代谢通路。本研究揭示了单独及联合施用KP3P9和K13C的促生效应，并为芽孢杆菌介导的延迟移栽草莓生长促进的代谢基础提供了新见解。

研究背景与科学问题

草莓（Fragaria × ananassa）作为全球重要的经济水果作物，其商业化生产中广泛采用穴盘基质育苗技术。穴盘苗相比传统裸根苗具有成活率高、无需缓苗期、提早成熟等优势。然而，移栽时机是决定穴盘苗生长发育的关键因素。最佳移栽窗口约为扦插后4–7周，此时根系已充分占据穴孔容积。若未能及时移栽，根系会从底部排水孔伸出并在穴盘内缠绕，形成“根系束缚”或“穴盘约束根”现象。这种延迟移栽会导致根系提取困难、基质脱落、机械损伤，进而降低移栽质量，引发根系受损、生长活力下降、花芽分化推迟等一系列生产问题，最终影响果实商品性和经济效益。

植物生长促进微生物（PGPM），尤其是芽孢杆菌属（Bacillus）细菌，因其能形成抗逆内生孢子、代谢多样性丰富、根际竞争能力强等特点，在促进作物生长方面展现出巨大潜力。已有研究表明，芽孢杆菌可通过固氮、溶磷、产铁载体、合成植物激素、重塑根系构型、优化根际微生物组、增强抗氧化防御等多种机制促进植物生长，并且其作用涉及宿主代谢组的重编程。在草莓栽培中，芽孢杆菌类接种剂已被证实可改善果实产量、光合效率和采后品质。然而，关于芽孢杆菌对延迟移栽草莓幼苗的促生效果及其对根系代谢组的影响，此前尚未见报道。

基于此，研究人员利用前期从苹果根际土壤中分离的两株具有促生活性的芽孢杆菌——暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）KP3P9（简称K9）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）K13C（简称KC），以12周龄‘红颜’草莓穴盘苗（已延迟移栽约5–8周）为研究对象，设置单独接种KP3P9（K9组）、单独接种K13C（KC组）、联合接种KP3P9+K13C（KK组）及未处理对照（CK组）四个处理，系统评估了各处理对延迟移栽草莓植株生长、鲜重及根系构型的影响，并结合非靶向代谢组学技术深入分析了根系代谢组的响应模式。该研究不仅揭示了芽孢杆菌处理对延迟移栽草莓的促生效应，还首次阐明了不同接种方式下根系代谢变化的内在机制，为芽孢杆菌在草莓育苗中的实际应用提供了理论依据。

主要关键技术方法

1. 1.
   细菌悬浮液制备与接种：将KP3P9和K13C单菌落分别接种于灭菌LB液体培养基，37℃、180 rpm振荡培养24 h，调整OD₆₀₀至1.0（约5.0×10⁸ CFU/mL），再用无菌蒸馏水稀释三倍获得接种悬浮液。选取健康一致的12周龄草莓穴盘苗，随机分为四组，每组约100株。接种前停水两天，每株浇灌25 mL相应菌悬液（K9组为KP3P9悬浮液，KC组为K13C悬浮液，KK组为等体积混合液，CK组为无菌稀释LB培养基），24 h后重复接种一次。随后将所有穴盘苗移栽至装有栽培基质的栽培槽中，在温控日光温室中继续培养三个月。
2. 2.
   生长参数测量：三个月后统计各组存活率，并随机取样测定株高、冠径、叶柄长、叶片数、地上部鲜重、根鲜重和植株总鲜重。
3. 3.
   根系扫描与分析：随机取六株植株，轻柔清洗根部基质后，使用ScanMaker i800 Plus GXY-A根系表型分析系统测定总根长、平均根直径、根体积、根表面积、根投影面积和根尖数等根系构型参数。
4. 4.
   交叉划线拮抗试验：为检测两菌株间的拮抗作用，按Hossain（2024）方法进行交叉划线试验。先将一株菌沿LB平板中心划线，37℃倒置培养12 h后，再将另一株菌垂直横跨划线，继续培养16 h后观察相互作用表型。
5. 5.
   非靶向代谢组学分析：从各组随机选取15株植株采集根系，每五株根系合并为一个生物学重复，每组三个重复。样品经液氮研磨后，用甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v）提取液提取代谢物，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）平台进行非靶向代谢组学分析。原始数据经MassLynx V4.2采集后导入Progenesis QI软件进行对齐、解卷积和峰拾取，通过与Waters METLIN MS/MS数据库及公共光谱库比对注释代谢物。基于核心代谢物骨架、生物合成起源和经典生化分类，将鉴定到的代谢物划分为两级嵌套分类体系（Class I级和Class II级）。利用R语言的prcomp函数进行主成分分析（PCA），使用pheatmap包绘制热图。
6. 6.
   差异累积代谢物（DAM）筛选与富集分析：以变量重要性投影（VIP）≥1、p<0.05且|log₂（倍数变化（FC））|≥1为标准，在各处理组与CK组之间筛选DAM。使用R语言的VennDiagram包进行韦恩分析。将DAM映射到KEGG COMPOUND数据库，以Fisher精确检验p<0.05为阈值确定显著富集的代谢通路。

研究结果

3.1 芽孢杆菌接种对延迟移栽草莓生长的影响

移植三个月后，CK、K9、KC和KK组的存活率分别为92.59%、98.91%、100%和98.98%。表型观察发现，与芽孢杆菌处理组相比，CK组草莓植株根系较弱、叶片较少，尤其是新叶。生长参数测量结果显示，K9、KC和KK组的平均株高均显著高于CK组，分别为CK组的1.30、1.40和1.53倍。KC和KK组的平均冠径也显著大于CK组，分别达到CK组的1.30和1.33倍。KC组的平均叶柄长度显著增加，为CK组的1.46倍。K9和KC组的平均叶片数显著高于CK组，分别为CK组的1.67和1.62倍。这表明三种芽孢杆菌处理均能有效促进延迟移栽草莓的地上部生长。

3.2 芽孢杆菌接种对延迟移栽草莓鲜重的影响

鲜重测量结果显示，K9、KC和KK组的根鲜重、地上部鲜重和植株总鲜重均显著高于CK组，分别约为CK组的4.17、4.09和3.22倍（根鲜重），5.99、6.21和5.11倍（地上部鲜重），以及5.10、5.17和4.18倍（植株总鲜重）。这说明芽孢杆菌处理显著提升了延迟移栽草莓的生物量积累。

3.3 芽孢杆菌接种对延迟移栽草莓根系构型的影响

根系扫描分析表明，K9、KC和KK组的平均根直径均显著大于CK组，分别为CK组的1.26、1.36和1.25倍。KC组的根体积显著高于CK组和KK组，约为CK组的2.14倍和KK组的1.91倍。K9和KC组的根表面积和投影面积均较CK组显著增加，均约为CK组的1.87和1.92倍。相反，KK组的根尖数显著低于CK组。这些结果表明，单菌株处理（K9/KC）与联合处理（KK）对延迟移栽草莓根系构型参数的影响存在差异。

3.4 KP3P9与K13C之间的拮抗作用交叉划线试验

由于KK处理在大多数测量指标上的促生效果弱于单菌株处理（KC和K9），研究人员推测KP3P9与K13C之间存在拮抗作用。交叉划线试验证实了两者之间存在抑菌带，表明这两株芽孢杆菌确实存在相互拮抗。这解释了为何联合处理的促生效果相对较弱，而其更优的株高和冠径促进效果可能源于改变的根际定殖模式、代谢产物互作或宿主植物的差异化响应。

3.5 延迟移栽草莓根系代谢组学分析

共从草莓根系中检测到16,963个峰，成功注释了4,443种代谢物。各组内生物学重复间相关性极高（r>0.993），表明数据重现性和可靠性良好。组间相关性分析显示，K9与CK组的代谢组相关性最高（r=0.917–0.922），其次为KC与CK组（r=0.875–0.881），KK与CK组相关性最低（r=0.810–0.815），表明KK处理对根系代谢组的影响最大。PCA分析也证实K9组与CK组最为接近。代谢物Class I级分类涵盖17个类别，包括脂质、酮/醛/酯类、萜类等。比较各组Class I级代谢物的总峰面积发现，所有三种处理均显著降低了黄酮类、酮/醛/酯类、木脂素、核苷酸、苯丙素类和糖类的含量，同时显著增加了甾体类物质含量。K9和KC处理显著提升了多酚和萜类含量；KC处理还显著增加了醇类、生物碱和香豆素含量；而KK处理则特异性增加了氨基酸含量。三种处理对脂质、有机酸、醌类和维生素的总含量无显著影响。

3.6 四组间差异累积代谢物的鉴定

以VIP≥1、p<0.05为标准，在CK_vs_K9、CK_vs_KC和CK_vs_KK比较中分别鉴定出705、1,149和1,821个DAM。CK_vs_K9中包含465个下调、240个上调代谢物；CK_vs_KC中包含547个下调、602个上调代谢物；CK_vs_KK中包含1,348个下调、473个上调代谢物。韦恩分析显示，CK_vs_KK比较中含有最多的特有DAM（918个），其次为CK_vs_KC（344个）和CK_vs_K9（63个）。三个比较共有436个共同DAM。在136个共同上调的代谢物中，脂质和酮/醛/酯类占比最高；在275个共同下调的代谢物中，萜类和脂质占主导地位，其次为酮/醛/酯类和糖类。进一步分析各比较中上/下调幅度最大的前20个DAM，发现它们主要属于脂质、酮/醛/酯类、萜类、多酚、有机酸、核苷酸、香豆素和糖类。值得注意的是，两个代谢物（anabaenopeptin MM823和2-formamido-N1-(5’-phosphoribosyl)acetamidine）在所有比较中一致上调，五个代谢物（chlorantene E、3-undecylphenol、5-heptyl-6,8-dimethyloctahydroindolizine、stearamide和(5α)-sarmentogenin 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranoside]）一致下调。

3.7 三组比较中DAM的KEGG富集分析

CK_vs_K9比较的DAM显著富集于三个通路：泛酸和辅酶A生物合成（p=0.0312）、角质化包膜形成（p=0.0312）和氨酰tRNA生物合成（p=0.0409），其特征性DAM包括L-缬氨酸、泛酰巯基乙胺-4’-磷酸盐、焦谷氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。CK_vs_KC比较的DAM显著富集于酪氨酸代谢（p=0.0470）和α-亚麻酸（ALA）代谢（p=0.0470），其特征性DAM包括5-羧甲基-2-羟基粘康酸、氢醌、龙胆酸、2,5-二羟基苯甲醛、3-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯、13(S)-HpOTrE、12-OPDA、9(S)-HOTrE、2(R)-HPOT和9,10-EOT。CK_vs_KK比较的DAM显著富集于黄酮生物合成通路（p=0.0104），其特征性DAM包括芹菜素、5-O-咖啡酰莽草酸、松属素、根皮素、花青素、白杨素和圣草酚。

讨论与结论

讨论部分指出，移栽时机是草莓生产中决定成活率和生长的关键因素。本研究中，三种芽孢杆菌处理均显著提高了延迟移栽草莓的株高和鲜重，表明两株菌均能有效促进延迟移栽草莓的生长。根系扫描分析进一步揭示了芽孢杆菌接种促进了穴盘约束根系的构型恢复，可能恢复了吸收和代谢功能，从而支持了地上部生长。交叉划线试验证实的菌株间拮抗作用，解释了联合处理促生效果相对较弱的原因。

非靶向代谢组学揭示了芽孢杆菌接种后根系代谢网络的重塑。所有处理均增加了甾体类物质，可能通过维持膜流动性和作为油菜素内酯前体来改善膜稳定性并促进生长信号传导；同时降低了黄酮类、苯丙素类和糖类等与胁迫防御相关的代谢物，暗示代谢从防御/维持转向生长恢复。不同处理呈现出独特代谢特征：K9和KC提升了多酚和萜类；KC特异性增加了醇类、生物碱和香豆素；KK则特异性上调了氨基酸。KEGG富集分析进一步支持了菌株特异性机制：K9处理涉及泛酸和CoA生物合成及氨酰tRNA生物合成，可能促进蛋白质和脂质代谢以修复根系；KC处理涉及酪氨酸代谢和ALA代谢，与胁迫响应密切相关；KK处理则特异性富集于黄酮代谢。

研究局限性包括：缺乏正常移栽对照组，难以区分缓解延迟移栽效应与一般促生效应；单时间点代谢组学只能提供快照，需时间序列采样刻画动态响应；特定DAM与促生表型间的因果关系有待靶向验证；单菌与联合处理产生不同结果的机制需转录组和植物激素水平探索；芽孢杆菌处理对草莓果实品质和产量的影响有待研究。

结论翻译：本研究表明，KP3P9、K13C及其联合处理均能改善延迟移栽草莓的生长。非靶向代谢组学揭示了处理相关的根系代谢重编程，涉及甾体类、黄酮类、酮/醛/酯类、木脂素、核苷酸、苯丙素类和糖类的共同变化，以及多酚、萜类和氨基酸的处理特异性改变。KEGG富集分析进一步表明，单菌和联合施用影响了不同的代谢通路，揭示了芽孢杆菌介导的延迟移栽草莓生长促进中存在共性和菌株特异性机制。这些发现为理解芽孢杆菌如何改善延迟移栽草莓的生长提供了新见解。