Phytopythium helicoides与智利甜樱桃根腐病相关：鉴定、致病性及衰退症状发生率

《Plants》：Phytopythium helicoides Associated with Root Rot of Sweet Cherry in Chile: Identification, Pathogenicity, and Incidence of Decline Symptoms

　　

Phytopythium属物种最近被认为是影响全球多种作物的重要土传病原体。然而，其在智利甜樱桃（Prunus avium）中的发生和致病性此前尚未被研究。本研究旨在鉴定与樱桃植株根腐衰退相关的Phytopythium分离物，并在受控条件和田间评估其致病性。研究人员记录了症状，并从瓦尔帕莱索（Valparaíso）地区一个商业果园采集了嫁接在Maxma14砧木上的樱桃植株样品。研究人员使用选择性培养基获得分离物，并基于形态学特征以及内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、细胞色素c氧化酶亚基I（cytochrome c oxidase subunit I, COX I）和β-微管蛋白区域的分子分析对其进行表征。基于三个串联区域的系统发育分析支持将这三个分离物归入Phytopythium helicoides支系。商业果园三个区域的衰退症状发生率范围为24.3%至42.8%。致病性试验包括通过基质浇灌300 mL游动孢子悬浮液（1×10⁴ zoospores/mL）接种一年生嫁接在MaxMa14砧木上的Prunus avium 'Lapins'植株，并在接种后90天进行评估。与未接种的对照组相比，接种植株表现出生长减少、叶部症状和根坏死。这些发现证实了Phytopythium helicoides对樱桃树具有致病性，并强调了其作为智利樱桃生产系统中一种新兴土传病原体的作用。

# 论文解读：Phytopythium helicoides在智利甜樱桃根腐病中的鉴定、致病性及田间发生率

## 研究背景与目的

土传卵菌是农作物根腐和冠腐的重要病原，长期受到关注的主要是疫霉属（Phytophthora）和腐霉属（Pythium）。近年来，原被归入Pythium clade K的类群被确立为独立属——Phytopythium属（Phy.），其形态特征介于Pythium和Phytophthora之间，包括具乳突的孢子囊、内增殖以及游动孢子在外囊泡中分化等。世界各地已报道该属多种物种可侵染草本和木本寄主，例如Phy. helicoides引起草莓冠腐病和杜鹃花根腐病，Phy. chamaehyphon与猕猴桃藤蔓衰退相关。在Prunus属中，Phy. vexans曾在观赏樱花上被确认致病，Beluzán等人在杂交砧木上证实了Phy. helicoides的致病潜力。然而，在智利甜樱桃（Prunus avium）上，Phy.属物种的发生和致病性此前从未被研究。甜樱桃是智利重要的鲜果出口作物，幼树根系衰退会严重影响果园建立。然而，生长势下降、叶片黄化、萎蔫和根系恶化等田间症状并不特异，必须结合病原分离、形态与分子鉴定以及接种试验才能确定病原种类及其贡献。本研究旨在：对从智利Valparaíso地区一个商业甜樱桃园衰退植株根部获得的Phytopythium分离物进行形态和多基因系统发育鉴定；量化三个果园区域的衰退症状发生率；并采用两次独立接种试验评估分离物对嫁接在MaxMa14砧木上的‘Lapins’甜樱桃的致病性。

## 主要关键技术方法

样本来源为智利Valparaíso地区一个商业甜樱桃园，样品取自嫁接在MaxMa14砧木上的两年生植株。研究人员从病根边缘切取组织，表面消毒后接种于添加匹马霉素和万古霉素的选择性玉米粉琼脂培养基（CMA）上进行分离。对代表性分离物进行菌落形态、孢子囊形态观察，并测量菌丝径向生长速率。分子鉴定采用内转录间隔区（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）和线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COX I）三个标记的PCR扩增和Sanger测序，通过BLASTn比对和最大似然法构建多基因串联系统发育树。田间调查对三个扇区共5681株树进行目测分级（健康、轻度、中重度），计算衰退症状发生率。致病性试验采用基质浇灌法，将一年生‘Lapins’嫁接苗接种300 mL游动孢子悬浮液（1×10⁴ zoospores/mL），90天后评估株高、地上部鲜重、根长、根鲜重、根坏死率和疾病严重度，并进行再分离。

## 研究结果

### 2.1 分离物的形态学特征

对分离物PUCV 2372和PUCV 2368进行了形态学表征。两者在CMA上均产生白色气生菌丝，无特殊生长型，平均径向生长速率为15.75 mm day^?1。PUCV 2372主要产生椭圆形具乳突孢子囊（23.4 ± 2.3 × 14.6 ± 1.4 μm），部分具排放管，可见内增殖；PUCV 2368主要产生球形无乳突孢子囊（直径19.3 ± 2.9 μm），偶有具乳突和卵形孢子囊。研究期间（两周）未观察到有性结构。这些特征符合Phy.属的典型形态，但两个分离物的优势孢子囊形状存在差异，提示应综合多个特征进行鉴定。

### 2.2 分离物的分子鉴定与系统发育分析

BLASTn分析显示，PUCV 2369和PUCV 2372的ITS、β-tubulin和COX I序列均与Phy. helicoides参考序列最高相似（99.13%–99.71%）。而PUCV 2368的ITS序列与Phy. chamaehyphon（GenBank登录号PP087944.1）100%一致，但其β-tubulin和COX I序列却与Phy. helicoides最高相似（分别为99.65%和100%）。基于ITS–β-tubulin–COX I串联数据集的最大似然系统发育分析将三个智利分离物均置于Phy. helicoides支系，该支系与Phy. chamaehyphon分离，自展支持率为99%。PUCV 2372与参考分离物H5聚在一起（自展支持率94%）。尽管PUCV 2368的ITS结果存在冲突，但多基因联合分析支持其属于Phy. helicoides。

### 2.3 果园衰退症状发生率

田间目测评估发现，三个扇区的衰退症状发生率分别为：扇区1为24.3%（306/1260），扇区2为42.8%（978/2285），扇区3为32.5%（695/2136）。该发生率代表视觉评估的衰退症状频率，不能直接视为Phy. helicoides导致的病害发病率。从三个扇区随机采集的根系样本中均分离到了Phy.，但未分离到Phytophthora属。

### 2.4 对樱桃植株的致病性评估

两次独立接种试验结果一致。第一次试验中，未接种对照组（T0）保持无症状，无根坏死，生长量较大。接种处理对株高（F_3,16 = 0.787，p = 0.518）、根长（F_3,16 = 2.428，p = 0.103）和根鲜重（F_3,16 = 1.956，p = 0.161）无显著影响，但对地上部鲜重影响显著（F_3,16 = 8.056，p = 0.0017）。PUCV 2369和PUCV 2372接种植株的地上部鲜重显著低于对照，PUCV 2368则处于中间水平。疾病严重度方面，PUCV 2368接种植株为1级（叶片黄化、活力轻度降低），根坏死率75%；PUCV 2369接种植株为1级，根坏死率50%；PUCV 2372接种植株为2级（萎蔫、部分落叶和枯梢），根坏死率75%；对照为0级，无根坏死。Kruskal–Wallis检验及Conover事后比较显示，除PUCV 2369与对照在部分比较中无显著差异外，其余接种处理均与对照显著不同。第二次试验重复验证了根部坏死和地上部症状的出现，所有接种处理均产生70%、75%和65%的根坏死率，疾病严重度评分达2、2.2和2.4，而对照无症状。再分离结果显示，两次试验中Phy.的回收频率为60%–100%，对照均未回收，且再分离菌落形态与原始分离物一致。

## 讨论与结论

研究发现Phy. helicoides与智利甜樱桃根腐衰退相关，并通过接种证实其致病性。形态与分子证据表明三个分离物均属于Phy. helicoides，但PUCV 2368的ITS序列与Phy. chamaehyphon一致，这一位点特异性差异尚未解决。致病性试验中，虽然部分生长参数未达显著差异，但根部坏死和地上部症状的出现及病原再分离成功，为病原学关系提供了有力支持。田间衰退症状发生率（24.3%–42.8%）仅反映视觉衰退，不能直接归因于该病原。研究存在局限性，如仅测试一个品种–砧木组合、三个分离物，且评估者知道处理分组可能引入观察者偏差。未来研究应扩大分离物和砧木范围，采用盲法评估，并调查灌溉水、土壤和杂草作为病原来源的可能性。

研究结论如下：本研究提供了Phy. helicoides与智利一个商业甜樱桃园根腐和衰退症状相关的证据。形态学表征和多基因分析支持了分离物的鉴定，尽管PUCV 2368的ITS不一致结果仍未解决。实验接种证明了其在嫁接于MaxMa14砧木上的Prunus avium 'Lapins'上的致病性，两次试验均观察到根坏死和地上部症状。在第一次试验中，两个分离物显著降低了地上部鲜重，而对株高、根长和根鲜重的处理效应不显著。三个调查扇区的视觉衰退症状发生率为24.3%至42.8%；这些数值并不代表专门由Phy. helicoides引起的病害发生率。总体而言，这些发现支持该病原可能对调查果园的根系健康问题有贡献，并提示应将其纳入甜樱桃衰退的诊断检测。进一步研究应评估其分布、其他品种–砧木组合的易感性以及与病害发展相关的环境条件。