《Plants》：Optimized Callus Subculture and Multi-Omics Analysis Reveal Somatic Embryogenesis Bottlenecks in the Cold-Resistant Rubber Tree Clone GT1
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橡胶树（Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.）是全球天然橡胶的主要来源，然而由于其对低温敏感，其栽培主要局限于热带地区。尽管耐冷无性系GT1在扩大栽培纬度以及作为遗传转化受体方面具有相当大的潜力，
橡胶树（Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.）是全球天然橡胶的主要来源，然而由于其对低温敏感，其栽培主要局限于热带地区。尽管耐冷无性系GT1在扩大栽培纬度以及作为遗传转化受体方面具有相当大的潜力，但相对于优良无性系热研7-33-97（R73397），其体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis, SE）能力低下严重限制了其应用。尽管此前已进行培养基优化研究，但GT1高效的愈伤组织继代培养体系仍未建立，其体细胞胚胎发生顽拗性的分子基础也尚不清楚。本研究建立了一种采用脉冲式植物生长调节剂（plant growth regulators, PGRs）方案的重复GT1愈伤组织继代培养体系，并整合比较转录组学、全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）以及基于Tn5足迹分析的转座酶可及染色质测序（Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing, ATAC-seq），以阐明GT1与R73397之间的调控瓶颈。研究结果表明，尽管GT1愈伤组织并未完全丧失表征胚胎发生倾向的基因表达，但其未能完成向球形胚的形态发生转变，这可能是由于对胚胎模式形成至关重要的转录因子水平降低所致。表观遗传学分析表明，这些调控因子的差异表达与DNA甲基化或染色质可及性并无紧密关联，但揭示了两种基因型之间不同的转座元件沉默机制。此外，层级式转录因子-DNA结合网络的构建预测了若干此前已被报道可正向调控体细胞胚胎发生的转录因子在基因调控网络中的位置。综上，本研究克服了GT1愈伤组织多次继代培养的技术瓶颈，并为鉴定促进耐冷橡胶树育种中体细胞胚胎发生的精确遗传靶点提供了多组学框架。
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一、研究背景与科学问题
橡胶树（Hevea brasiliensis）是全球天然橡胶最主要的来源，但其栽培因低温敏感性而严格局限于热带地区。推广耐冷品种可在一定程度上扩大橡胶种植的地理范围和规模。主栽无性系GT1及其衍生无性系表现出较强的耐冷性，若将其作为遗传工程的受体材料，将为耐冷性改良提供优良的遗传背景。然而，GT1体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis, SE）率极低，严重制约了其在这方面的应用。相比之下，热研7-33-97（R73397）的花药愈伤组织诱导和遗传转化体系已相当成熟，是目前橡胶树遗传工程的主要受体无性系。
尽管目前可通过多种途径实现GT1的愈伤组织诱导，但通过优化培养基成分和植物生长调节剂（plant growth regulators, PGRs）配比来建立高效愈伤组织继代培养体系并提高其体细胞胚胎发生率的尝试一直未取得理想结果。为克服GT1体细胞胚胎发生的顽拗性，有必要将其体细胞胚胎发生过程中的转录谱和基因调控网络与胚胎发生能力良好的R73397进行全面比较，从而揭示GT1低胚胎发生率的决定性因素。
二、研究内容与主要结论
研究人员首先通过全基因组重测序（whole-genome resequencing, WGS）对田间材料进行无性系身份验证，主成分分析（principal component analysis, PCA）确认实验材料确为GT1。随后建立了GT1花药愈伤组织的交替继代培养策略：在GT1愈伤组织诱导培养基（含6-BA、2,4-D和GA3）与GT1继代培养基（含KT、NAA和TDZ）之间交替培养，成功实现了GT1花药愈伤组织的多次继代增殖，获得了生长旺盛、质地疏松的高质量愈伤组织。
在此基础上，研究人员对四种愈伤组织进行了转录组测序，包括GT1诱导期（GT1-induce）、R73397诱导期（R73397-induce）、GT1再分化期（GT1-rediff）和R73397再分化期（R73397-rediff）愈伤组织。以Padj ≤ 0.01和|log2FC| ≥ 1.0为阈值，在GT1-induce与R73397-induce之间鉴定出8561个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），在GT1-rediff与R73397-rediff之间鉴定出14723个DEGs。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，R73397高表达基因显著富集于“解剖结构发育”和“多细胞生物发育”等与胚胎复杂结构形成密切相关的生物学过程，而GT1愈伤组织在诱导期“程序性细胞死亡”过程更为活跃，在体细胞胚胎诱导期“生殖过程”更为活跃。值得注意的是，GT1-induce与R73397-rediff的跨阶段差异基因分析中，GT1高表达基因显著富集于“胚胎发育”通路，提示GT1愈伤组织中可能存在早期胚胎发生细胞，但其无法完成向球形胚的形态转变。
研究人员进一步对GT1-rediff和R73397-rediff愈伤组织进行了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和ATAC-seq分析。DNA甲基化分析显示，两种愈伤组织在基因区域的甲基化水平几乎一致，但GT1花药愈伤组织转座元件（transposable element, TE）区域的CHH甲基化显著低于R73397。染色质可及性分析显示，两种愈伤组织在基因区域的可及性水平几乎一致，但R73397的TE区域可及性明显高于GT1。关键转录因子的差异表达与DNA甲基化差异区域（differentially methylated regions, DMRs）和染色质差异可及区域（differentially accessible regions, DARs）均未表现出强关联。在127个关键转录因子中，仅5个携带DMRs，22个携带DARs。
基于ATAC-seq的Tn5转座酶足迹分析，研究人员构建了关键转录因子与“解剖结构发育”过程相关差异表达基因的转录因子-DNA结合网络，将转录因子划分为三个层级，并重点标注了此前已被报道可正向调控体细胞胚胎发生的基因，包括WOX8（LOC110633278）、NF-YA3（LOC110635766）、BBM、RKD4等。qRT-PCR验证了WOX8和NF-YA3在R73397中的高表达。值得注意的是，这两个基因的差异可及性区域均为R73397中可及性降低的区域，且紧邻TATA盒，研究人员推测这可能是由于活跃转录的RNA聚合酶占据所致。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：全基因组重测序（WGS）用于无性系身份验证；RNA测序（RNA-seq）用于比较转录组分析；全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）用于DNA甲基化分析；转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）结合Tn5足迹分析用于染色质可及性检测和转录因子结合位点预测；以及qRT-PCR用于基因表达验证。样本材料来源于中国海南省儋州（R73397）和三亚（GT1）的田间成熟植株花药。所有测序分析均以橡胶树参考基因组GCF_030052815.1_ASM3005281v1为比对参考。
四、讨论与结论
讨论部分指出，GT1体细胞胚胎发生的瓶颈不仅在于胚胎发生的起始，更在于形态发生转变阶段。即使存在全能性细胞，其也无法完成从单细胞向复杂多细胞结构转变所需的分化和重塑过程。GT1基因组中体细胞胚胎发生所需的关键基因基本完整，但未能被正确激活。127个关键转录因子均与“胚胎后发育”过程存在直接或间接的结合关联，表明这类基因在GT1中的沉默是胚胎发育受损的核心原因之一。
DNA甲基化和染色质可及性分析表明，关键转录因子的差异表达与表观遗传修饰无强关联。R73397的TE区域呈现高CHH甲基化伴随高染色质可及性的特征，而GT1则表现为低TE甲基化和低可及性，提示两种无性系可能采用不同的转座元件沉默策略。
研究最终提出将两个BBM基因、两个WOX基因、一个NF-YA3基因和一个RKD4基因作为后续通过遗传工程提高GT1体细胞胚胎发生率的候选靶基因，这些基因均位于转录因子调控网络的顶层。
研究结论可归纳为以下几点：交替使用GT1愈伤组织诱导培养基和继代培养基可实现GT1花药愈伤组织的多次继代增殖；GO富集分析表明GT1愈伤组织并未完全丧失表征胚胎发生倾向的基因表达，但未能表达胚胎发育中后期所需基因，这是其无法发育为体细胞胚的核心原因之一；关键转录因子的差异表达与基因组DNA甲基化水平和染色质可及性均无强关联；R73397的TE区域呈现较高的平均CHH甲基化水平伴随较高的平均染色质可及性，表明两种无性系间可能存在未知的转座子沉默机制差异；研究人员预测了关键转录因子在关键通路上的TF-DNA结合网络。
