《Plants》：Dual-Component Nanoemulsion Containing Brugmansia suaveolens Leaf Extract and Copaiba Oil: Antimicrobial Activity and Preclinical Wound-Healing Potential
编辑推荐：
中文摘要翻译
本研究开发并评估了一种含有木曼陀罗（Brugmansia suaveolens (Willd.) Sweet）氢乙醇叶提取物与柯柏伊巴油的双组分纳米乳（BSLE-NE）。研究人员分别采用高分辨率液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用
中文摘要翻译
本研究开发并评估了一种含有木曼陀罗（Brugmansia suaveolens (Willd.) Sweet）氢乙醇叶提取物与柯柏伊巴油的双组分纳米乳（BSLE-NE）。研究人员分别采用高分辨率液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）对BSLE和柯柏伊巴油进行了化学表征。通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对BSLE-NE进行了优化与表征。研究人员还在8、25和40 °C条件下对该制剂进行了为期28天的初步理化稳定性研究，并进行了抗菌活性、细胞相容性测定，以及使用雌性Wistar大鼠的切除性伤口模型评估。此外，还评估了BSLE的抗氧化活性。BSLE的化学图谱分析揭示了39个色谱特征，包括推定注释的托烷类生物碱，而β-石竹烯（48.91%）是柯柏伊巴油中的主要化合物。BSLE-NE表现出平均液滴直径为144 nm、多分散指数（PDI）为0.135，并呈球形形态。该制剂在8 °C和25 °C条件下维持纳米级液滴尺寸达28天。BSLE和BSLE-NE对肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）均表现出超过90%的相对抑制率。在BSLE等效浓度为500 μg mL?1时，纳米乳化将J774巨噬细胞活力从约61%提高至84%，同时在成纤维细胞和角质形成细胞中保持了高活力。在体内实验中，Copaiba-NE和BSLE-NE均较未处理对照组改善了伤口修复，而BSLE-NE产生了最小的残余伤口直径和最先进的组织结构。这些发现支持BSLE-NE作为整合了BSLE和具有生物活性的柯柏伊巴油的双组分局部制剂的临床前伤口修复潜力。
论文解读
一、研究背景与目的
皮肤伤口愈合是一个涉及炎症、细胞增殖和细胞外基质重塑等协调阶段的复杂动态生物学过程。这些过程的紊乱会延迟组织再生并增加继发感染的风险，而机会性病原体的存在可进一步维持炎症状态并损害组织修复。氧化应激在伤口病理生理中也发挥核心作用，通过促进细胞外基质降解和损害细胞功能来影响愈合进程。因此，需要能够同时控制微生物负荷和调节局部氧化还原环境的治疗策略。
植物来源的生物活性化合物因其抗氧化、抗炎和抗菌特性而被广泛研究。黄酮类和萜烯类化合物能够调节炎症通路、减轻氧化应激并促进组织再生。柯柏伊巴油作为一种富含萜类化合物的天然脂质相，可通过促进亲脂性化合物的分散并为皮肤递送提供生物学相关的脂质环境，支持局部制剂的发展。木曼陀罗（Brugmansia suaveolens (Willd.) Sweet）属于茄科植物，具有丰富的植物化学图谱，已报道超过120种成分，包括生物碱、黄酮类、萜类、甾体类等次生代谢物。该物种中鉴定的托烷类生物碱包括东莨菪碱、阿托品/莨菪碱、去甲阿托品及羟基化衍生物。
过去十年中，含有植物提取物或精油的纳米乳已从以制剂为中心的研究发展为评估抗菌活性和伤口修复的局部递送系统。在此框架内，将木曼陀罗提取物纳入化学表征的柯柏伊巴油基纳米乳，并结合全面的理化和生物学评估，构成了本研究的特定贡献。本研究旨在开发并表征含有木曼陀罗叶提取物的柯柏伊巴油基纳米乳，评估其液滴尺寸、pH值和28天初步理化稳定性，以及抗氧化和抗菌活性、体内伤口愈合潜力和实验动物模型中的系统安全性。
二、主要关键技术方法
研究人员采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱（UHPLC–ESI–QTOF–MS）对木曼陀罗氢乙醇叶提取物（BSLE）进行植物化学定性表征，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析柯柏伊巴油的化学成分。通过PASS在线服务器和SwissADME平台进行计算机模拟生物学活性和药代动力学性质预测。纳米乳采用探针超声处理的高能乳化法制备，使用Pluronic? F-127作为非离子稳定剂，并通过实验设计优化制剂组成和超声处理参数。采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征纳米乳的液滴尺寸、多分散指数（PDI）和形态。抗菌活性采用琼脂纸片扩散法评估，抗氧化活性采用DPPH自由基清除法测定，细胞相容性采用刃天青还原法在J774巨噬细胞、HaCaT角质形成细胞和人成纤维细胞中评估。体内伤口愈合实验使用15只雌性Wistar大鼠（300 ± 20 g，3月龄），建立8 mm直径的切除性伤口模型，分为未处理对照组、Copaiba-NE组和BSLE-NE组，每日局部给药20 μL，在第1、4、8、15天进行宏观和形态计量学分析，第15天进行组织病理学、生化和血液学评估。
三、研究结果
3.1 木曼陀罗叶提取物和柯柏伊巴油的化学特征
UHPLC–ESI–QTOF–MS分析在BSLE中检测到39个色谱特征，其中峰4-6被推定注释为东莨菪碱、3-羟基-6-噻格洛酰氧基托烷和去甲阿托品。GC-MS分析显示柯柏伊巴油含20种色谱组分，其中19种通过NIST质谱库鉴定，β-石竹烯为主要成分（48.91%），其次为桧烯D（7.70%）、α-石竹烯（6.88%）、α-古巴烯（6.33%）、α-喜马烯（5.88%）和δ-杜松烯（4.08%）。倍半萜烃及其含氧衍生物共占色谱图谱的93.17%，证实了柯柏伊巴油以倍半萜为主的组成特征。
3.2 生物学活性和药代动力学性质的计算机模拟预测
PASS分析显示东莨菪碱具有预测的抗炎（Pa = 0.742）和伤口愈合刺激（Pa = 0.689）活性，莨菪碱/阿托品具有预测的抗炎（Pa = 0.715）和抗菌（Pa = 0.621）活性，去甲阿托品具有预测的抗菌活性（Pa = 0.598），β-石竹烯具有预测的抗炎（Pa = 0.854）和抗菌（Pa = 0.712）活性。SwissADME预测表明托烷类生物碱具有中等分子量、中等亲脂性和预测的皮肤渗透系数（log Kp）在?5.62至?5.81 cm s?1之间，β-石竹烯具有最高亲脂性（log P = 4.52）、TPSA为0.0 ?2和最高的预测皮肤渗透性（log Kp = ?4.62 cm s?1）。
3.3 纳米乳的优化和理化表征
通过实验设计优化，BSLE-NE表现出平均液滴直径为144 nm、PDI为0.135，表明形成了具有窄液滴尺寸分布的纳米级体系。TEM确认了以球形为主的纳米级液滴。28天稳定性研究表明，在8 ± 0.5 °C和25 ± 0.5 °C条件下，BSLE-NE维持纳米级液滴直径，而在40 ± 0.5 °C条件下观察到更明显的PDI变化。pH值随时间下降，但仍保持在适合局部应用的范围内，且未观察到可见的乳析或相分离。
3.4 BSLE和BSLE-NE的抗菌活性
双因素方差分析显示制剂与微生物之间存在显著交互作用（F(6,28) = 4.149；p = 0.0042）。BSLE和BSLE-NE对肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌均表现出超过90%的抑制率，且两种制剂间无显著差异。对于白色念珠菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌，BSLE-NE表现出与BSLE相当的抗菌活性。对于解脂耶氏酵母，纳米乳化显著降低了抗菌活性（p = 0.0278）。相反，BSLE-NE对金黄色葡萄球菌的抑制显著高于BSLE（p = 0.0126）。
3.5 BSLE的DPPH自由基清除活性
BSLE表现出浓度依赖性的DPPH自由基清除活性，抑制率从5 μg mL?1时的19.00%增加至500 μg mL?1时的70.50%。在500 μg mL?1时，BSLE显著高于槲皮素（70.50% vs. 54.00%；p < 0.0001），在50、25和5 μg mL?1时也观察到显著差异。
3.6 细胞毒性评估
在人成纤维细胞中，所有样品均维持活力高于ISO定义的70%阈值，BSLE约为91%活力，BSLE-NE、Pluronic? F-127和柯柏伊巴油维持约97%或更高。在HaCaT角质形成细胞中，所有样品维持活力高于90%。在J774巨噬细胞中，BSLE将细胞活力降至约61%，低于ISO 10993-5:2009的70%阈值，而BSLE-NE维持巨噬细胞活力约84%，表明纳米乳化减弱了游离提取物在该细胞模型中的细胞毒性。
3.7 体内伤口愈合评估
宏观评估显示所有实验组在第4至15天之间伤口进行性闭合，BSLE-NE治疗组病变尺寸减小更为显著。在第15天，BSLE-NE治疗产生最小残余伤口直径约0.025 mm，显著低于未处理对照组（约1.200 mm；p = 0.0038）和Copaiba-NE组（约0.425 mm；p = 0.0095）。Copaiba-NE也较未处理对照显著减小伤口直径（p = 0.0078）。
3.8 伤口愈合的组织病理学评估
第15天的H&E染色切片显示，未处理对照组表现出较不有序的组织结构和较不先进的修复结构特征，而BSLE-NE组表现出更先进的上皮组织和更结构化的肉芽组织。半定量评分显示BSLE-NE组获得最高总组织病理学评分11/12，其次为Copaiba-NE组8/12和未处理对照组5/12。所有组均实现完全再上皮化，但BSLE-NE在角化、肉芽组织组织、瘢痕隆起指数和组织重塑方面得分更高。
3.9 生化和血液学评估
ALT和AST水平未超过雌性Wistar大鼠的已发表参考区间，肌酐浓度范围为0.40至0.64 mg dL?1，尿素浓度范围为30.8至42.6 mg dL?1。然而，两个治疗组的总白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数均低于各自参考区间，虽然未伴随生化异常或全身毒性的临床症状，但需谨慎解读并进一步研究。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，BSLE中推定注释的托烷类生物碱是茄科植物的特征性成分，与多种药理活性相关。柯柏伊巴油的倍半萜组成与已发表的柯柏伊巴油特征图谱一致，β-石竹烯含量（48.91%）与文献报道的48.29%高度吻合。计算机模拟预测表明所选化合物具有互补的生物学和理化性质，但这些预测需要实验验证。纳米乳的理化特性反映了探针超声处理高能乳化的有效性，Pluronic? F-127通过在油水界面形成稳定层来限制液滴聚集和合并。抗菌活性的微生物依赖性结果与提取物和制剂的化学复杂性一致。BSLE的抗氧化活性支持其作为局部递送系统组分的合理性。纳米乳化改善了巨噬细胞中的细胞相容性，同时维持成纤维细胞和角质形成细胞的高活力。体内伤口愈合结果表明BSLE-NE促进皮肤伤口闭合，但需考虑啮齿动物皮肤含panniculus carnosus肌肉的种间差异。组织病理学发现表明BSLE-NE不仅改善了伤口闭合速率，还改善了修复组织的结构组织。生化数据未显示明显的肝或肾功能改变，但白细胞减少的发现排除了关于系统安全性的确定性结论。
研究结论：定性UHPLC–ESI–QTOF–MS分析检测到BSLE中39个色谱特征，包括三个推定注释的托烷类生物碱。柯柏伊巴油表现出以β-石竹烯为主要成分的倍半萜组成。优化的BSLE-NE是一种Pluronic? F-127稳定的水包油纳米乳，具有纳米级液滴、低多分散性、主要为球形形态和初步短期理化稳定性。纳米乳化保留了BSLE对最敏感细菌菌株的抗菌活性，特别是肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌，同时改善了J774巨噬细胞中的细胞相容性，并维持了人成纤维细胞和HaCaT角质形成细胞的高活力。在实验条件下，BSLE-NE较未处理对照和Copaiba-NE产生了最小的残余伤口直径和最先进的组织结构。这些发现支持BSLE-NE作为整合BSLE和生物活性柯柏伊巴油的双组分局部制剂的临床前伤口修复潜力，但需要进一步研究以确定纳米乳化的制剂特异性贡献并更严格地建立其安全性和转化潜力。
