《SCIENCE ADVANCES》：Transmembrane delivery of antimicrobial peptides by engineered eCIS into macrophages for intracellular mycobacteria elimination
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结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）是一种持续存在于巨噬细胞内的胞内菌，可导致慢性感染和耐药性。为解决跨膜限制并提高治疗精准性，研究人员采用光杆细菌毒力盒（*Photorhabdus* virulence ca
结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）是一种持续存在于巨噬细胞内的胞内菌，可导致慢性感染和耐药性。为解决跨膜限制并提高治疗精准性，研究人员采用光杆细菌毒力盒（*Photorhabdus* virulence cassette, PVC）——一种典型的细菌胞外收缩注射系统（extracellular Contractile Injection System, eCIS），将抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）递送入巨噬细胞，以实现胞内分枝杆菌的清除。研究人员证明，多种胞内分枝杆菌（包括耻垢分枝杆菌（*M. smegmatis*）、牛分枝杆菌（*M. bovis*）、结核分枝杆菌及其异烟肼耐药株）的存活均可被PVC介导的AMP跨膜递送显著抑制。经工程化改造的PVC装载分枝杆菌噬菌体来源的AMP，并通过与表面受体CD11b结合靶向肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages, AMs），可在小鼠感染模型中清除驻留于AM内的分枝杆菌并减轻炎症。值得注意的是，在H37Rv感染的 mice 中，肺部分枝杆菌载量降低了十倍以上。总之，该研究代表了工程化PVC介导的生物大分子胞内递送入巨噬细胞的开创性应用，为抗分枝杆菌感染提供了一种新型治疗策略。
### 论文解读文章
**一、研究背景与问题**
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）引起的慢性呼吸道传染病。据《2025年全球结核病报告》，2024年全球新发结核病例1070万，Mtb重新成为单一传染源所致死亡的首要原因，全年死亡123万人。当前标准抗结核治疗方案包含2个月强化期（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺）和4个月继续期（利福平、异烟肼），但疗程长、依从性差，且耐多药/利福平耐药结核（MDR/RR-TB）和广泛耐药结核（XDR-TB）亟需更复杂的个体化方案。Mtb具有富含分枝菌酸的独特复杂细胞壁，且能在巨噬细胞内存活并形成肉芽肿，逃避宿主免疫清除，使得消灭Mtb极为困难。因此，迫切需要将精准抗菌药物递送与增强Mtb储存库穿透相结合的新型治疗策略。
抗菌肽（AMPs）因其广谱抗菌活性、不易诱发耐药、快速杀菌及免疫调节功能，被视为有前景的抗结核候选药物，但其临床应用受限于蛋白酶敏感、特异性低、生物利用度差和规模化生产成本高等问题。为克服这些技术障碍，研究人员致力于开发基于生物载体或纳米载体的靶向递送策略。光杆细菌毒力盒（PVC）是一种典型的胞外收缩注射系统（eCIS），可利用鞘收缩驱动内部刺突穿透细胞膜，将货物蛋白注入真核细胞。已有研究表明，PVC可在N端信号肽引导下装载多种蛋白货物，且其尾纤维蛋白Pvc13可通过修饰结合域重编程受体特异性，因此PVC有望成为精准递送平台。
**二、研究目的与总体结论**
研究人员开发了一种基于工程化PVC的靶向递送系统，将AMPs跨膜递送入巨噬细胞，用于清除胞内分枝杆菌。结果显示，装载分枝杆菌噬菌体来源的D29 LysA和D29 LysB组合的工程化PVC-CD11b复合物，在体外能显著抑制多种胞内分枝杆菌（包括耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG株、结核分枝杆菌H37Ra及异烟肼耐药H37Ra，甚至高毒力H37Rv），在体内小鼠肺感染模型中可大幅降低肺部分枝杆菌载量并减轻组织病理损伤，且无明显毒性。该研究为结核病精准治疗提供了新策略。
**三、关键技术方法**
研究人员使用的主要技术方法包括：①三质粒共表达系统（结构质粒pCNM3、调控质粒pBR60和货物质粒pBBRN）在大肠杆菌EPI300中高效生产PVC复合物，并经两步超速离心纯化；②通过基因工程将CD11b结合域（DARPin）融合至Pvc13 C端，构建靶向巨噬细胞的PVC-CD11b；③采用Western blot和透射电镜（TEM）验证货物装载及颗粒形态，纳米颗粒追踪分析（NTA）测定粒径；④利用CCK-8法评估细胞毒性，通过菌落形成单位（CFU）计数、共聚焦荧光显微术和qPCR评估胞内杀菌效果与炎症因子表达；⑤在小鼠肺感染模型中采用气管雾化吸入方式给药，结合组织病理学（HE染色、抗酸染色）、ELISA和转录组学分析评估体内疗效与机制。样本队列来源包括THP-1、MH-S、A549、HeLa细胞系（ATCC）以及C57BL/6小鼠原代肺泡巨噬细胞（BAL获取）和体内感染模型。
**四、主要研究结果**
**1. 工程化PVC可将蛋白货物递送入巨噬细胞**
研究人员以细胞毒性蛋白TcsT为模型货物，验证了PVC-R7（携带腺病毒5-knob RGD/PK7结合域）能将TcsT有效递送入THP-1巨噬细胞、小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S和小鼠原代AMs，而空载体无明显细胞毒性，证明PVC-R7可作为一种向巨噬细胞递送蛋白的可行载体。
**2. AMPs可被PVC-R7装载并递送以清除胞内M. smegmatis**
研究人员将多种AMP（D29 LysA、D29 LysB、MS6 LysA、MS6 LysB、颗粒溶素、HNP1）成功装载入PVC-R7。在M. smegmatis感染的THP-1巨噬细胞模型中，多种AMP均显著降低胞内菌载量，其中D29 LysA和LysB联用效果最佳（约14.3倍降低）。系统发育分析显示D29 LysA和LysB同源蛋白广泛分布于多种分枝杆菌噬菌体属及部分细菌基因组，提示其多样的进化储库。
**3. D29 LysA和LysB经PVC-R7递送抑制胞内分枝杆菌并减轻细胞炎症**
利用GFP标记的M. smegmatis结合共聚焦显微镜观察，发现PVC-R7递送D29 LysA/LysB显著降低GFP阳性细胞比例和胞内荧光强度。对照实验表明，无PVC递送时，即使使用5倍剂量的纯化D29 LysA/LysB也无明显抗分枝杆菌活性，证明PVC介导的跨膜递送是必需的。同时，D29 LysA/LysB处理还显著下调IL-6和TNF-α转录水平，并在MH-S和原代AMs中均呈现一致效果，对BCG和H37Ra也具抑制作用。
**4. 修饰的PVC-CD11b复合物对巨噬细胞具有特异性识别**
研究人员将抗CD11b DARPin融合至Pvc13 C端构建PVC-CD11b。结构预测和TEM表明其保持典型鞘管结构，NTA显示主峰粒径123 nm。TEM直接观察到PVC-CD11b颗粒附着于THP-1巨噬细胞表面。Western blot证实PVC-CD11b可在信号肽引导下装载TcsT，并递送入巨噬细胞发挥细胞毒作用；无信号肽的对照蛋白无法被装载。在低表达CD11b的A549和HeLa细胞中，PVC-CD11b几乎无细胞毒性，而PVC-R7则杀伤明显，表明PVC-CD11b巨噬细胞靶向特异性显著提高。
**5. PVC-CD11b装载D29 LysA和LysB对胞内分枝杆菌有效**
PVC-CD11b成功装载D29 LysA和LysB，TEM/NTA显示形态完好。在M. smegmatis感染模型中，装载复合物显著降低胞内菌载量，共聚焦结果验证其杀菌效果。对H37Ra和异烟肼耐药H37Ra的胞内感染，PVC-CD11b递送也显著降低菌载量，提示其作用靶点可能独立于一线抗结核药物。对高毒力H37Rv感染，单次给药无显著效果，两次连续给药后胞内菌显著减少，提示剂量依赖效应。
**6. PVC-CD11b装载D29 LysA和LysB清除肺部分枝杆菌并减轻炎症**
在小鼠气道雾化感染模型中，D29 LysA/LysB-PVC-CD11b处理使肺内M. smegmatis载量降低4.3倍（约0.63 log10），HE染色显示炎症浸润减轻、肺泡壁增厚缓解、组织结构保留更好，血清TNF-α水平降低。转录组分析显示576个差异表达基因（DEGs）富集于PPAR信号通路等脂质代谢与炎症调控通路。在H37Ra感染模型中，处理组肺内H37Ra载量降低5.7倍（约0.76 log10），肺部及全身炎症均减轻；转录组分析发现DEGs富集于黏着斑、蛋白消化吸收和糖胺聚糖生物合成等通路。两个模型均富集TNF、MAPK和AMPK信号通路，提示D29 LysA/LysB可能兼具直接杀菌和宿主免疫代谢调节的双重功能。
**7. 靶向PVC治疗可减轻高毒力M. tuberculosis感染小鼠的肺部载量**
在H37Rv急性感染小鼠模型中（5×10? CFU感染，感染后2天开始每2天雾化给药1.0 mg，共3或6次），与空载PVC处理组相比，D29 LysA/LysB-PVC-CD11b处理组在3次给药后呈下降趋势（约2倍），6次给药后肺内H37Rv载量显著降低约18倍。Ziehl-Neelsen染色显示处理组肺内抗酸杆菌显著减少；HE染色示处理组肺部病变轻，炎症浸润面积减小，无明显实质损伤；血清TNF-α和IFN-γ呈下降趋势（未达统计学显著）。整个实验期间小鼠体重稳定，提示治疗耐受性良好。
**五、讨论总结与结论**
该研究证实，PVC递送系统可有效避免AMPs的蛋白降解和低靶向性等临床瓶颈。雾化吸入给药使药物直达肺部感染灶，且空载PVC未见明显毒性，提示其生物安全性较好。通过对PVC尾纤维Pvc13受体结合域的改造，可实现向肺泡巨噬细胞的精准递送。D29 LysA与D29 LysB分别作用于分枝杆菌细胞包膜的不同成分——LysB为分枝菌酰阿拉伯半乳聚糖酯酶，可切割分枝菌酸与阿拉伯半乳聚糖之间的酯键；LysA则可水解肽聚糖层，二者协同促进分枝杆菌裂解。PVC介导的胞内递送使这两种酶能够到达含菌吞噬体或胞质内逃逸的分枝杆菌，发挥杀菌作用。此外，转录组结果提示其还可能通过调节宿主脂质代谢和免疫应答产生间接抗感染效果。研究人员指出，未来需在更高等动物模型中评估药代动力学、免疫反应和长期毒性，并可通过优化蛋白序列、严格调控表达、采用耐受宿主等策略提高产量。总体而言，装载AMPs的PVC-CD11b复合物作为一种可吸入的新型抗分枝杆菌治疗策略，具有重要的临床转化潜力，并对扩展eCIS在感染性疾病治疗中的应用具有重要意义。
