《Toxins》：Occurrence and Dietary Exposure Assessment of Patulin and Major Alternaria Toxins in Commercial Infant Fruit Purées from Italian and Spanish Markets Using Targeted Analysis and Suspect Screening
编辑推荐：
本研究旨在评估供婴幼儿食用的水果泥中多种真菌毒素的共存情况并评价其膳食健康风险，研究方法整合了靶向定量、膳食暴露评估与高分辨质谱可疑筛查。研究人员从意大利市场（n = 20）和西班牙市场（n = 20）随机采集了40份苹果含量各异的水果泥样本。研究人员开发并验
本研究旨在评估供婴幼儿食用的水果泥中多种真菌毒素的共存情况并评价其膳食健康风险，研究方法整合了靶向定量、膳食暴露评估与高分辨质谱可疑筛查。研究人员从意大利市场（n = 20）和西班牙市场（n = 20）随机采集了40份苹果含量各异的水果泥样本。研究人员开发并验证了一种适用于同时测定棒曲霉素（patulin, PAT）及三种交链孢毒素——包括交链孢酚（alternariol, AOH）、交链孢酚单甲醚（alternariol monomethyl ether, AME）和细交链孢菌毒素（tentoxin, TEN）——的适配型超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS）方法，该方法具有良好的灵敏度、准确度和精密度。靶向分析结果显示PAT、AOH和AME频繁共存，而TEN未被检出。膳食暴露评估表明，PAT带来的健康风险可忽略不计，而AOH和AME在所有评估人群组中均超过各自的毒理学关注阈值（Thresholds of Toxicological Concern, TTCs），表明交链孢毒素是膳食风险的主要贡献者。高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）可疑筛查通过鉴定细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid）、暂定鉴定交链孢菌素（altenusin）和黄曲霉毒素G2（aflatoxin G2），并注释了2,3-二羟基苯甲酸（一种可能干扰PAT测定的物质），扩展了真菌毒素谱。总体而言，本研究提出的工作流程为婴幼儿水果泥中真菌毒素监测提供了综合策略，并支持加强对新兴交链孢毒素的监测。
论文解读
一、研究背景与问题的提出
水果及水果制品是健康饮食的重要组成部分，因其富含维生素、矿物质、膳食纤维和生理活性化合物而被广泛推荐。然而，新鲜水果具有高度易腐性，水果加工成为延长货架期、减少采后损失和扩大消费机会的重要策略。在加工水果制品中，水果泥和水果泥混合物广泛被婴幼儿和幼儿消费，往往构成其饮食中的主食类食品。真菌毒素是由丝状真菌（主要为曲霉属、青霉属、镰刀菌属和交链孢属）产生的有毒次级代谢产物，可在收获前和收获后阶段污染多种农作物。尽管加工过程中采用了技术处理，源自受感染原料的真菌毒素可能因热稳定性强而无法被常规加工步骤完全去除，从而持续存在于水果泥中。婴幼儿和幼儿由于其单位体重食物摄入量更高、解毒系统发育不成熟以及饮食多样性有限，对此类膳食暴露尤为敏感。已有研究将这种暴露与一系列急性和慢性不良健康效应相关联，包括胃肠道疾病、免疫抑制、内分泌干扰活性、致癌作用以及婴幼儿和幼儿的神经发育迟缓。
在水果及水果制品相关的真菌毒素中，棒曲霉素（PAT）是研究最深入的毒素，主要由扩展青霉产生，是仁果类水果青霉腐烂病的病原体，被广泛视为苹果及苹果制品的质量和安全指标。近年来，交链孢毒素作为水果和蔬菜商品中的新兴污染物受到越来越多的关注。链格孢属真菌产生大量次级代谢产物，其中交链孢酚（AOH）、交链孢酚单甲醚（AME）、细交链孢菌酮酸（TeA）和细交链孢菌毒素（TEN）在食品中最常被报道。值得注意的是，交链孢毒素通常由同一真菌菌株同时产生，其联合暴露可能导致叠加或协同毒性效应。此外，多种真菌毒素可能发生植物或真菌生物转化为修饰形式或" masked "形式，这些共轭物仍具有毒理学相关性，但通常逃逸常规靶向分析。
从监管角度看，欧盟第2023/915号法规仅对PAT设定了统一最高限量，规定婴幼儿和幼儿水果制品中PAT限量为10 μg/kg。相比之下，交链孢毒素尚未正式纳入法规管理，欧盟委员会第2022/553号建议仅针对有限食品类别提供了AOH、AME和TeA的指示性水平，且未涵盖婴幼儿水果制品。这一监测空白，加上气候变化对地中海地区这些毒素分布和共存格局的预期影响，凸显了对可靠多分析物发生数据的迫切需求。
尽管靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析和基于高分辨质谱（HRMS）的可疑筛查方法均可用于真菌毒素检测，但婴幼儿水果泥中多种真菌毒素的发生和膳食暴露数据仍然有限，且大多数已发表研究仅关注PAT，或未整合可疑筛查策略来探索这些产品的更广泛真菌毒素谱。因此，本研究旨在通过靶向UHPLC-MS/MS评估意大利和西班牙市场上销售的水果泥中PAT和三种交链孢毒素的发生情况，结合HRMS可疑筛查探索更广泛的真菌代谢物谱，并基于靶向定量数据进行膳食暴露评估。
二、研究开展的工作与主要结论
研究人员开发并验证了一种结合超声辅助提取（UAE）和分散固相萃取（d-SPE）净化步骤的适配型UHPLC-MS/MS方法，用于同时测定水果泥中的PAT、AOH、AME和TEN。通过对质谱检测参数、色谱分离条件和样品前处理程序的系统优化，该方法在灵敏度、准确度和精密度方面均表现良好，满足欧盟法规对婴幼儿食品中PAT限量监测的要求。
将该方法应用于从意大利和西班牙市场采集的40份商业水果泥样本后，靶向分析揭示了PAT、AOH和AME的频繁共存，而TEN未被检出。膳食暴露评估结果表明，PAT在所有评估人群组中的暴露量远低于其每日耐受摄入量，健康风险可忽略不计；而AOH和AME在所有性别和年龄分层中均超过了各自的毒理学关注阈值（TTC），表明交链孢毒素是婴幼儿水果泥膳食风险的主要贡献者。HRMS可疑筛查进一步扩展了真菌毒素谱，鉴定出TeA，暂定鉴定出altenusin和黄曲霉毒素G2，并注释了2,3-二羟基苯甲酸——一种可能与PAT具有相同元素组成和相似裂解模式从而干扰PAT鉴定的物质。
三、主要关键技术方法
本研究采用了以下主要技术方法：（1）超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（UHPLC-MS/MS）靶向定量方法，在多重反应监测（MRM）模式下对PAT、AOH、AME和TEN进行同时定性和定量分析；（2）高分辨质谱可疑筛查工作流程，基于UHPLC-Orbitrap-HRMS平台，结合Compound Discoverer软件和包含多种真菌毒素精确质量数的Mass List进行特征筛选和化合物鉴定；（3）超声辅助提取结合分散固相萃取（UAE-d-SPE）的样品前处理方法；（4）确定性膳食暴露评估方法，结合国家特异性发生数据和消费者平均摄入量计算估计每日摄入量，并采用毒理学关注阈值和危害商数进行风险表征。样本来源方面，研究人员于2024年2月至3月期间从意大利（n = 20）和西班牙（n = 20）零售市场随机采集了40份苹果含量各异的商业水果泥产品。
四、研究结果
方法优化与验证。研究人员通过单变量方法对样品前处理进行了优化，遵循绿色样品制备原则，实现了样品和溶剂体积的微型化，减少了试剂和吸附剂用量，缩短了处理时间。最终采用含1%甲酸的乙腈进行超声辅助提取10分钟，以50 mg Florisil作为分散固相萃取吸附剂进行净化。方法验证结果表明，线性相关系数R2高于0.98，AOH、AME和TEN的定量限为0.1 μg/kg，PAT为0.5 μg/kg，远低于欧盟法规设定的10 μg/kg最高限量；回收率为76%至112%，精密度RSD均满足20%的接受限。
商业样本中的毒素发生情况。在40份商业水果泥样本中，PAT、AOH和AME被广泛检出且频繁共存，TEN在所有样本中均未检出。意大利样本中PAT、AOH和AME的发生率分别为25%、75%和80%，西班牙样本中分别为10%、60%和75%。两国均呈现PAT < AOH < AME的发生模式。PAT浓度在意大利样本中为1.16~11.60 μg/kg，在西班牙样本中为1.48~2.81 μg/kg，其中一份意大利样本（11.60 μg/kg）超过了欧盟第2023/915号法规规定的10 μg/kg最高限量。AOH和AME在意大利样本中最高分别达8.67和4.60 μg/kg，在西班牙样本中分别达6.92和5.90 μg/kg。Spearman秩相关分析未发现苹果含量与任一交链孢毒素浓度之间存在显著关联，这可能是由于样本量有限及混合水果泥中其他水果成分的贡献。
膳食暴露与风险表征。结合国家特异性发生数据和消费者平均摄入量计算估计每日摄入量，并按国家、年龄组和性别分层。在所有评估人群组中，AOH暴露量为其TTC的2.84至9.79倍，AME为其TTC的1.46至7.14倍，表明存在筛查水平的暴露关注。相比之下，PAT的最高危害商数仅为0.022（占每日耐受摄入量的2.2%），TEN的最高暴露-TTC比率为0.000255。意大利样本中AOH暴露量为0.00710~0.01289 μg/kg bw/day，西班牙样本中为0.01323~0.02449 μg/kg bw/day。西班牙女性婴儿对AOH和AME的暴露量最高，意大利女性幼儿对其他毒素的暴露量最高。AOH和AME的联合暴露危害指数在意大利为4.30~7.81，在西班牙为9.21~16.94，表明累积筛查水平关注。基于下界和上界估计的AOH和AME安全阈值超标结果表明，非检出替代并非驱动安全阈值超标的主要因素。
可疑筛查分析。通过UHPLC-Orbitrap-HRMS可疑筛查工作流程，检测特征从4011个减少至190个。目标毒素PAT、AME、AOH和TEN在质控样本中被成功鉴定，证实了工作流程的可靠性。此外，TeA在40份样本中的5份中被检出并通过分析标准品确认，altenusin被推测性鉴定为Schymanski分类的Level 2置信度，黄曲霉毒素G2被指定为Level 3置信度。重要的是，研究人员注解了在水果泥样本中持续检出且在色谱上与PAT邻近的峰为2,3-二羟基苯甲酸。该化合物与PAT具有相同的元素组成和相似的裂解模式，可能在HRMS库搜索中被误认为PAT，强调了充分色谱分离和谨慎谱图解读的重要性。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，AOH和AME在所有调查人群分层中均超过安全阈值，而PAT和TEN远低于各自参考值，这一模式与欧洲膳食评估中报道的多个人群组AOH和AME暴露超过2.5 ng/kg bw/day TTC的结果一致。研究人员强调，TTC超标不应被解释为等同于超过基于健康的指导值或不良健康效应的定量证据，而应根据EFSA的框架解读为需要额外化合物特异性毒理学信息的需求。与先前意大利62份商业苹果泥调查相比，本研究最大AOH估计每日摄入量与之前报道几乎相同，而最大意大利PAT估计每日摄入量约低一个数量级，这与本研究使用的较低平均PAT发生浓度一致。与阿根廷苹果副产物评估的比较进一步支持了AOH和AME的优先关注。研究人员指出，PAT低危害商数不应被解释为替代逐批次合规控制，因为平均发生量暴露评估和法规合规性回答的是不同的问题。监测最终加工产品尤为重要，因为热处理可以灭活活真菌但不一定能消除毒素。本研究的优势在于使用国家特异性发生数据、性别特异性消费数据、对婴幼儿和其他儿童进行分别分层以及对左删失结果进行明确的下界和上界处理。研究不确定性包括每国仅20份样本的有限样本量、确定性评估方法无法刻画个体暴露的完整分布，以及评估仅涵盖四种毒素而非全部真菌毒素类别。
研究结论部分可翻译为：本研究成功开发并验证了一种快速且适配的UAE-d-SPE-UHPLC-MS/MS方法，用于同时测定供婴幼儿食用的商业水果泥中PAT和交链孢毒素。该方法具有良好的灵敏度、准确度和精密度，被证明适用于这些污染物的常规监测。靶向分析揭示了意大利和西班牙市场水果泥中PAT、AOH和AME的频繁共存。尽管PAT暴露远低于其基于健康的指导值，但AOH和AME在所有评估人群组中均超过其各自的TTC值，确定这些毒素是膳食风险的主要贡献者。这些发现凸显了对供婴幼儿和幼儿食用的食品中交链孢毒素进行持续监测和进一步毒理学评估的必要性。此外，HRMS可疑筛查工作流程扩展了目标分析物之外的真菌毒素谱，实现了TeA、ALT和AFG2的暂定鉴定，以及2,3-二羟基苯甲酸（一种在色谱分离不足时可能干扰PAT鉴定并导致HRMS库搜索或靶向方法中假阳性鉴定的化合物）的注解。这些结果证明了HRMS可疑筛查在改进复杂水果基质中污染物表征和避免假阳性鉴定方面的互补价值。总体而言，本研究提供了一个整合靶向UHPLC-MS/MS定量、HRMS可疑筛查和膳食暴露评估的综合分析与风险评估框架，为婴幼儿水果泥贡献了有价值的发生数据，并支持未来关于新兴真菌毒素的监测策略和监管决策。
