《Journal of Fungi》：Divergence Time Determines the Performance of the Fungal Internal Transcribed Spacer (ITS) DNA Barcode in the Lichen-Forming Ascomycete Genus Parmelina
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分子研究已反复证明，基于形态的物种界定常常低估地衣型真菌的多样性，将不同的演化谱系隐藏于同一物种名之下。在 Parmelina 属（一种地衣型子囊菌，其现存多样性起源于中新世和上新世）中，近期已识别出若干隐存种。本研究评估了真菌DNA条形码标记——内转录间隔区
分子研究已反复证明，基于形态的物种界定常常低估地衣型真菌的多样性，将不同的演化谱系隐藏于同一物种名之下。在 Parmelina 属（一种地衣型子囊菌，其现存多样性起源于中新世和上新世）中，近期已识别出若干隐存种。本研究评估了真菌DNA条形码标记——内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）——在区分不同演化时间分化的物种方面的效能。ITS能够可靠地区分所有起源于中新世的物种，这些物种的种内与种间遗传距离形成了清晰、无重叠的条形码间隙（barcode gap）（0.0137–0.0162 substitutions/site）；但ITS未能解析在上新世辐射分化的两个物种复合群。基于先前在类大叶梅地衣（parmelioid lichens）中建立的遗传距离阈值所进行的条形码间隙分析得出一致结果，既确认了中新世谱系的物种区分能力，也揭示了两个上新世物种复合群当前界定中的不一致性。研究人员还提供了一个经过整理的ITS DNA条形码参考文库，包含749个准确鉴定的标本，覆盖 Parmelina 属的整个地理分布范围。扩展的标本采样进一步揭示了 P. clandestina 在希腊、匈牙利、印度、挪威、斯洛伐克和瑞士的新国家记录，以及 P. mediterranea 在法国、希腊、摩洛哥、土耳其和瑞士的新记录。研究结果表明，真菌ITS条形码的区分能力取决于物种分化的演化年龄：能够成功识别较古老的谱系，但对近期分化的类群则显示出局限性。基于距离的自动化界定方法ABGD和ASAP均独立恢复了每一个中新世谱系，将 P. atricha 分为两个实体，并将整个 P. tiliacea 复合群归入单一分区，进一步证实了这一结论。
一、研究背景与问题
DNA条形码（DNA barcoding）通过使用短的标准DNA序列进行物种鉴定，已深刻改变了生物多样性测量、评估与监测的方式。物种鉴定的基础是经过整理的条形码参考文库，通过将未知生物的DNA序列与已鉴定类群的序列进行比对来实现鉴定。DNA条形码在物种边界认知、生物多样性准确评估、隐存种（cryptic species）评价及生物群落组成研究等方面做出了重要贡献。然而，大多数生物类群，包括共生真菌，仍缺乏可用于上述目的的DNA条形码参考数据。地衣型真菌约占已描述子囊菌多样性的三分之一，是陆地生态系统的重要组成部分，在基质风化、碳氮循环及环境污染生物指示等方面发挥关键生态作用，同时还能合成具有药理研究价值的独特次生代谢产物。然而，地衣型真菌的物种界定长期处于变动之中。传统上基于表型特征进行物种鉴定，但当诊断性状存在表型可塑性或掩盖了形态相同或相似但实际不同的物种时，这种方法可能产生误导。越来越多的证据表明，基于形态的物种界定低估了地衣型真菌的多样性，将不同的系统发育谱系隐藏于同一物种名之下。在 Parmelina 属中，多基因系统发育研究已反复揭示隐存种的存在，但迄今尚无研究对该属全属范围内ITS条形码的适用性进行系统评估。Parmelina 属隶属于Parmeliaceae（地衣型真菌最大科）的类大叶梅核心类群，其现存界定包含11个分布于北半球的物种。该属的多样化发生于中新世和上新世，不同支系在不同时间发生分化，这使其成为检验DNA条形码方法效能的理想对象。本研究旨在：（1）检验先前建立的类大叶梅ITS条形码间隙（barcode gap）在 Parmelina 属物种鉴定中的效率；（2）评估其效能是否依赖于谱系的演化年龄；（3）识别物种复合群中的候选种和隐存谱系。
二、研究内容与主要结论
研究人员分析了 Parmelina 属8个物种共749个标本的ITS序列数据，其中270条序列为本研究新生成，464条来自先前研究，15条从GenBank获取。新生成序列主要来自西班牙（95）、瑞士（64）、葡萄牙（62）、意大利（21）、摩洛哥（18）和美国（10）。系统发育分析显示，所有 Parmelina 样本构成一个支持良好的单系群，分为六个支持良好的单系支系。其中，P. yalungana、P. cryptotiliacea、P. quercina、P. carporrhizans 和 P. coleae 各自形成单系支系，而 P. atricha 呈并系（paraphyletic），其样本分属两个亚支系（E1和E2），其中E2与 P. carporrhizans 形成姐妹关系。P. tiliacea 复合群的所有样本构成一个支持良好的单系支系，但内部关系未能解析。遗传距离分析表明，所有在中新世分化的谱系，其种内最大遗传距离为0.0137 substitutions/site（s/s），种间最小距离为0.0162 s/s，形成清晰无重叠的条形码间隙，能够可靠区分。而 P. tiliacea 复合群内，种内和种间距离高度重叠，12.9%的配对比较在0.015 s/s阈值下被错误分类。P. clandestina 的样本在系统发育分析中被分为两个亚支系（F2和F4），合并分析时其种内距离超过阈值，且两个亚支系在地理分布上显著分离：F4主要分布于西地中海地区（83%来自西班牙、葡萄牙和摩洛哥），而F2集中于中欧、南欧和西南亚。自动化物种界定方法ABGD和ASAP均独立恢复了所有中新世谱系，将 P. atricha 分为两个实体，并将整个 P. tiliacea 复合群归入单一分区。
三、关键技术与方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：基于ITS区域（ITS1、5.8S和ITS2）的Sanger测序获取序列数据；使用MAFFT v7进行序列比对；采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛（Bayesian MCMC）方法进行系统发育分析；基于GTR模型计算成对遗传距离；采用先前在类大叶梅地衣中建立的0.015–0.017 s/s条形码间隙阈值进行物种区分判定；使用自动条形码间隙发现（Automatic Barcode Gap Discovery，ABGD）和自动物种分区（Assemble Species by Automatic Partitioning，ASAP）两种距离-based自动化物种界定方法进行无先验假设的物种划分。
四、研究结果
4.1 系统发育分析
基于749条ITS序列的系统发育分析表明，所有 Parmelina 样本构成支持良好的单系群，分为六个主要支系（A–F）。支系A包含 P. yalungana 和中国的一例 Parmelina sp.；支系B为 P. cryptotiliacea；支系C为 P. quercina；支系D为 P. coleae；支系E包含 P. atricha 和 P. carporrhizans，分为三个支持良好的亚支系（E1、E2、E3），其中 P. atricha 呈并系；支系F为 P. tiliacea 复合群，包含五个支持良好的亚支系（F1–F5），但内部关系未解析。ITS数据单独能够解析所包含的10个接受种中5个种的单系性。
4.2 遗传距离分析
在中新世分化的谱系中，种内最大距离为0.0137 s/s，种间最小距离为0.0162 s/s，形成清晰条形码间隙。P. tiliacea 复合群的种内和种间距离高度重叠，在0.015 s/s阈值下有12.9%的配对比较被错误分类。P. atricha 的两个亚支系合并分析时种内距离超过阈值，分别分析时则低于阈值。P. clandestina 的两个亚支系合并分析时种内距离超过阈值，且两个亚支系在地理分布上显著分离。
4.3 自动化物种界定
ABGD恢复10个分组，ASAP恢复8个和9个子集。两种方法均完全恢复了所有中新世谱系，将 P. atricha 分为两个分区（对应亚支系E1和E2），并将全部469个 P. tiliacea 复合群标本归入单一分区。
五、讨论与结论
本研究的遗传距离分析支持系统发育研究的结论，即 Parmelina atricha 的物种界定需要进一步研究。两个亚支系（E1+E2）合并分析时遗传距离超过阈值，但分别分析时符合种内距离特征。P. clandestina 的两个亚支系不仅遗传上不同，地理分布也显著分离，且合并分析时核苷酸多样性（π = 0.0075）是各亚支系单独分析的5–6倍，符合地衣型真菌中隐存种的典型模式。ITS条形码在 Parmelina 属中新世分化支系中的成功鉴定与其他地衣型真菌类群的研究结果一致，但在近期分化的支系中分辨率降低。这种分辨率不足可能由多种非排他性机制导致：自上新世分化以来单一较短位点积累的替代过少；连续物种形成事件间隔相对于有效种群规模过短，导致祖先多态性在物种形成过程中保留，谱系分选不完全；rDNA顺反子在串联阵列内协同进化，均质化可能消除近期获得的诊断变异；不完全隔离谱系之间的基因流也不能排除。解决这些复合群需要利用全基因组数据，在多种物种溯祖框架下分析，并结合接触地带的群体水平采样。本研究建立的ITS条形码参考文库是迄今首个基于749个准确鉴定标本、覆盖 Parmelina 属全球分布范围的综合性物种级DNA条形码数据集，对中新世分化的谱系鉴定可靠，同时明确标示了两个上新世复合群中单一位点条形码无法支持物种级鉴定的局限，为未来环境变化条件下的物种监测提供了基础。
