MaMHR调控蝗绿僵菌产孢、逆境适应与致病力的功能研究

《Journal of Fungi》：MaMHR Contributes to Conidiation, Stress Adaptation, and Virulence in Metarhizium acridum

　　

摘要专业翻译 蝗绿僵菌（Metarhizium acridum）是一种重要的昆虫病原真菌，被广泛用于蝗虫害虫的生物防治。尽管Zn2Cys6转录因子调控真菌多种发育和应激响应过程，但含MHR结构域的Zn2Cys6转录因子的功能仍知之甚少，尤其是在昆虫病原真菌中。本研究通过靶向基因敲除和回补实验，在M. acridum中鉴定了MaMHR——一个此前未被表征的、含有真菌转录因子中间同源区（MHR）的Zn2Cys6转录因子。MaMHR缺失导致分生孢子萌发延迟，在1/4 SDAY和SYA培养基上分生孢子产量分别降低约17.6%和28.3%，并使产孢方式从微循环产孢转变为正常产孢模式。ΔMaMHR突变体对UV-B照射和湿热胁迫的耐受性也受损，UV-B和热胁迫半数抑制时间（IT50）分别降低约26.5%和22.6%，同时对部分化学胁迫的耐受性降低。此外，MaMHR缺失使黑色素积累减少约47.0%，扰乱活性氧（ROS）稳态，改变抗氧化酶活性，并影响UV-B胁迫后核苷酸切除修复相关基因的表达，而海藻糖积累未受影响。MaMHR的破坏还降低了真菌在体表侵染过程中的毒力，表现为半数致死时间（LT50）增加约14.6%，并减少与体壁穿透相关的真菌生长，而血腔注射后的毒力未受显著影响。综上，这些发现表明MaMHR可能通过调控氧化应激、黑色素生物合成和DNA修复相关响应，参与真菌发育、环境胁迫适应和宿主侵染过程。

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论文解读

一、研究背景与科学问题

昆虫病原真菌是可持续害虫治理中的重要生物防治因子，具有环境安全、寄主特异性和抗性风险低等优势。其中，蝗虫霉（Metarhizium acridum）是对蝗虫具有高度寄主特异性的病原真菌，已在多个国家被开发并商业化用于蝗灾生物防治，是传统化学杀虫剂的重要替代方案。转录因子在真菌生长、发育、代谢和环境适应中发挥核心调控作用。Zn₂Cys₆型转录因子是真菌特有的一类最大调控蛋白家族之一，广泛参与碳氮代谢、次生代谢、产孢、发育和应激响应等过程。然而，其中含真菌转录因子中间同源区（MHR）的亚家族在昆虫病原真菌中的功能研究极为有限。已有研究表明白假丝酵母（Candida albicans）中Tac1和嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）中MHR1等含MHR的转录因子参与耐药性和纤维素酶调控，但在昆虫病原真菌中，此类蛋白是否参与产孢、应激响应和致病性尚未被系统研究。因此，本研究旨在鉴定并功能表征M. acridum中一个含MHR结构域的Zn₂Cys₆转录因子MaMHR，以揭示其在产孢调控、环境胁迫适应和毒力中的潜在作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员在M. acridum基因组中鉴定到一个编码Zn₂Cys₆型转录因子的基因（MAC_05848），该蛋白同时含有GAL4样Zn₂Cys₆DNA结合结构域和真菌转录因子中间同源区（fungal_TF_MHR）结构域，将其命名为MaMHR。通过靶向基因敲除和回补实验，构建了ΔMaMHR突变体和回补（CP）菌株，系统评估了该基因在发育、环境应激响应和毒力中的功能。研究发现MaMHR缺失导致分生孢子萌发延迟、产孢量下降、产孢方式改变、UV-B和湿热耐受性降低、黑色素合成减少、ROS稳态紊乱、抗氧化酶活性改变、DNA修复基因表达异常，以及体表侵染毒力下降。这些发现表明MaMHR在M. acridum的发育调控、环境适应和宿主侵染中发挥多重功能，为理解含MHR结构域的Zn₂Cys₆转录因子在昆虫病原真菌中的调控网络提供了新的见解。

三、主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：生物信息学分析（利用NCBI数据库获取序列，通过ProtParam预测蛋白质理化性质，CDD进行保守结构域分析，DNAMAN进行多序列比对，MEGA v7.0构建系统发育树）；基因敲除与回补（通过农杆菌介导转化构建ΔMaMHR突变体和回补菌株）；表型分析（包括分生孢子萌发率测定、产孢量统计、产孢模式显微观察）；环境胁迫耐受性评估（UV-B照射、45°C湿热处理、化学胁迫平板生长实验）；生理生化检测（黑色素含量分光光度法测定、ROS荧光探针检测、抗氧化酶活性试剂盒测定、海藻糖含量测定）；分子表达分析（RT-qPCR检测相关基因转录水平）；毒力测定（体表接种和血腔注射两种方式感染Locusta migratoria五龄若虫，结合体壁穿透实验）。所有实验均设置三个生物学重复。

四、研究结果

3.1 MaMHR的系统发育与结构分析。 通过生物信息学分析，在M. acridum基因组中鉴定到MaMHR基因，其编码蛋白同时含有GAL4样Zn₂Cys₆DNA结合结构域和真菌转录因子中间同源区（MHR）结构域。该基因全长2943 bp，无内含子，编码582个氨基酸，预测分子量为64.75 kDa，理论等电点（pI）为6.74。系统发育分析表明MaMHR与其他绿僵菌属物种的同源蛋白聚类关系密切。

3.2 MaMHR缺失延迟分生孢子萌发并降低产孢量。 与野生型（WT）和回补（CP）菌株相比，ΔMaMHR突变体的分生孢子萌发明显延迟，GT₅₀显著增加；在1/4 SDAY和SYA两种培养基上，ΔMaMHR突变体的产孢量均显著降低。

3.3 MaMHR缺失使产孢模式从微循环产孢转变为正常产孢。 在SYA培养基上，WT和CP菌株表现出典型的微循环产孢模式，而ΔMaMHR突变体则转变为正常产孢模式，产孢起始时间延迟至24小时以后。在1/4 SDAY培养基上，ΔMaMHR突变体同样表现出产孢起始延迟。

3.4 MaMHR缺失降低UV-B和热休克耐受性。 在UV-B照射和45°C热休克处理下，ΔMaMHR突变体的孢子萌发率显著低于WT和CP菌株，IT₅₀分别降低约26.5%和22.6%。

3.5 MaMHR缺失影响化学胁迫耐受性。 在渗透胁迫（山梨醇）、细胞壁完整性胁迫（CFW、CR）条件下，ΔMaMHR突变体的菌落直径和相对生长率均显著降低，而在H₂O₂和NaCl处理下无显著差异。

3.6 MaMHR缺失降低黑色素产量。 分光光度法检测显示ΔMaMHR突变体黑色素含量显著降低约47.0%，且黑色素合成相关基因（PksP、SCD、THR、Abr1、Tyr、HppD、LAC）的转录水平均显著下调。海藻糖含量在三个菌株间无显著差异。

3.7 MaMHR缺失影响ROS积累和抗氧化响应。 DCFH-DA染色显示ΔMaMHR突变体在UV-B和热胁迫后ROS荧光信号显著增强。RT-qPCR显示多个抗氧化酶基因（如SOD_1、CAT_1、GPX、MnSOD等）表达上调，且CAT和GPX酶活性在突变体中显著升高，但该补偿性响应不足以恢复ROS稳态。

3.8 MaMHR缺失影响核形态及DNA修复和热休克相关基因表达。 DAPI染色显示ΔMaMHR突变体在UV-B和热胁迫后细胞核呈现分散和不规则形态。UV-B处理后，多个核苷酸切除修复（NER）相关基因（RAD2、RAD3、RAD4、RAD10、RAD14、RAD23）在突变体中显著下调。热胁迫下，HSP40_1和HSP70_3表达上调，而HSP40_2下调。

3.9 MaMHR缺失降低体表侵染毒力但不影响血腔注射毒力。 体表接种实验中，ΔMaMHR突变体的LT₅₀显著延长约14.6%，且体壁穿透实验显示其穿透后真菌生长明显减少。但血腔注射后，三种菌株的致死率无显著差异，表明MaMHR的毒力缺陷主要发生在体壁穿透阶段。

五、讨论与结论

讨论部分指出，MaMHR是M. acridum中唯一可识别的含MHR的Zn₂Cys₆转录因子，其功能涉及多个生理过程。研究提出MaMHR可能通过调控氧化应激稳态、黑色素生物合成和DNA修复相关应答来影响真菌发育和环境适应。值得注意的是，突变体对外源H₂O₂敏感性不变，说明MaMHR更侧重于调控内源ROS稳态而非响应外源氧化剂。黑色素减少和NER基因表达异常共同加剧了突变体对UV-B和热胁迫的敏感性。毒力实验表明MaMHR主要参与早期侵染过程，尤其是体壁穿透相关生长。研究还指出，虽然MaMHR是唯一含MHR的Zn₂Cys₆转录因子，但其他Zn₂Cys₆家族成员可能存在功能冗余。

研究结论为：MaMHR缺失导致分生孢子萌发延迟、产孢量降低（1/4 SDAY和SYA培养基上分别降低约17.6%和28.3%）、产孢模式改变、体表毒力下降（LT₅₀增加约14.6%），而血腔注射毒力不受影响。在分子层面，MaMHR缺失使黑色素含量降低约47.0%，显著下调7个黑色素合成相关基因表达，UV-B和热胁迫IT₅₀分别降低26.5%和22.6%，而海藻糖含量不变。这些结果表明MaMHR通过调控氧化应激、黑色素合成和DNA修复相关应答来参与胁迫耐受，而海藻糖积累不是主要贡献因素。鉴于体壁穿透和UV-B耐受是田间真菌杀虫剂性能的重要决定因素，MaMHR有望作为通过遗传改良提高真菌胁迫耐受性和生物防治效果的候选靶点。