丝状真菌Trichocladium uniseriatum在土壤系统中的CO2固定机制：PEPC与PC在不同CO2和硫代硫酸盐条件下对碳分配的差异化调控作用

《Journal of Fungi》：Fungal CO2 Fixation in Soil Systems: Distinct Roles of PEPC and PC in Carbon Allocation Under Varying CO2 and Thiosulfate Conditions

　　

在升高的大气CO2浓度下，丝状真菌在土壤CO2固定中的作用仍知之甚少，特别是关于CO2固定酶的调控机制。本研究通过微宇宙培养实验，探究了葡萄糖（Glucose）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）和CO2浓度对单隔梭孢霉（Trichocladium uniseriatum）CO2固定能力的影响。实验采用全因子设计，设置三个葡萄糖水平（0、100和200 mg·kg?1）、三个Na2S2O3水平（0、50和100 mg·kg?1）以及两个13CO2水平（5%和10%）。分析了真菌菌落生长、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PC）的活性，以及不同土壤碳组分中13C的积累情况。结果表明，菌落直径受葡萄糖和Na2S2O3浓度的显著影响，在10% CO2条件下，中等水平（100 mg·kg?1葡萄糖和50 mg·kg?1 Na2S2O3）处理下观察到最佳生长。PC活性与CO2浓度呈负相关，但与Na2S2O3浓度呈正相关；而PEPC活性则与CO2和Na2S2O3均呈正相关。活性碳组分（溶解性有机碳DOC和微生物生物量碳MBC）中的δ13C丰度显著高于土壤有机碳（SOC），其中MBC的富集程度最高。随机森林模型识别出不同碳组分中13C积累的驱动因素各不相同：CO2和PEPC促进了SOC中13C的积累，而PC活性则驱动了13C向DOC和MBC的分配。偏最小二乘路径模型进一步揭示，PC和PEPC共同介导了13C向DOC的分配，其中PC特异性驱动13C进入MBC，而PEPC则将13C引导至SOC。这些发现表明，T. uniseriatum通过对PEPC和PC的差异化调控来介导CO2固定，从而影响固定的13C在土壤碳组分间的分配。本研究为在大气CO2变化情景下真菌驱动的CO2固定提供了机制性见解。

研究背景与科学问题

大气CO₂浓度持续上升加剧了气候风险。土壤作为陆地最大的碳库，每年吸收约10%的大气碳，是实现碳中和目标的关键。然而，陆地生态系统释放的CO₂约占大气CO₂浓度增加的60%，因此增强土壤固碳至关重要。土壤微生物是土壤碳循环的核心驱动力。“土壤微生物碳泵”（SMCP）概念框架描述了异养微生物如何通过“体内修饰”和“体外周转”调控土壤碳动态，并通过“埋葬效应”稳定微生物残体碳。更新的“SMCP概念框架2.0”纳入了自养微生物的碳固定途径，揭示了微生物可通过六种不同的固定路线直接同化大气CO₂，显著提升土壤碳汇潜力。研究表明，自养微生物的丰度与CO₂吸收率密切相关，它们在多种土壤生态系统中广泛分布，其碳固定速率持续补充土壤碳库。尤其在低肥力土壤中，微生物碳固定在利用CO₂提升土壤碳储量方面潜力巨大。

目前，土壤CO₂固定的研究主要集中在自养细菌和古菌上，关于真菌CO₂固定的研究极为有限。然而，升高的大气CO₂浓度可能使能量流更多地转向真菌而非细菌途径。全球表层土壤中真菌生物量碳预算估计为12 Pg C，是细菌的三倍。真菌在贫营养土壤中对CO₂固定的贡献更为显著。真菌可以通过异养和自养两种途径固定碳：异养固定主要依赖三羧酸循环回补反应中的丙酮酸羧化酶（PC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），其活性受高CO₂浓度显著影响；同时，有机碳源可通过调节中心碳代谢影响此过程。真菌的自养CO₂固定极为罕见。早期基于¹⁴C标记的研究表明，真菌可以完全依赖CO₂进行碳同化，并且还原性硫化合物（如Na₂S₂O₃）能有效刺激其自养生长的证据。

腐生真菌单隔梭孢霉（Trichocladium uniseriatum）因其高效降解纤维素和木质素等顽固碳化合物的能力而被广泛记录。除了分解作用外，其显著的自养CO₂同化能力已被证实，年固碳潜力约为0.008–0.01 Pg C。更重要的是，T. uniseriatum固定的超过80%的¹³C通过微生物生物量碳（MBC）库进入长寿命的矿物结合态有机碳库，突显了其在土壤固碳中的生态重要性。基因组分析已在T. uniseriatum中鉴定出多达46个与CO₂固定相关的基因，其中自养ATP柠檬酸裂解酶基因和提供能量的亚硫酸氧化酶基因的表达受SO₃^2?添加的调控。然而，回补关键酶PC和PEPC对CO₂固定的贡献，以及它们受碳源、还原性硫和CO₂浓度的调控机制尚不清楚。研究人员假设，T. uniseriatum的CO₂固定速率以及固定碳在土壤碳库间的分配，受到大气CO₂浓度、外源有机碳（如葡萄糖）和还原性物质（如Na₂S₂O₃）交互作用的共同调控。为验证这一假设，研究人员通过全因子设计接种T. uniseriatum进行了土壤微宇宙培养实验，旨在系统阐明这三种关键环境因子如何调控真菌生长动态、CO₂固定以及最终固定碳向不同土壤碳库的分配。研究结果为理解真菌驱动的土壤固碳过程提供了机制性见解。

主要关键技术方法

1. 1.
   土壤微宇宙培养实验：采用全因子设计，包括三个葡萄糖水平（0、100、200 mg·kg^?1）、三个Na₂S₂O₃水平（0、50、100 mg·kg^?1）和两个¹³CO₂水平（5%、10%），共18个处理，每个处理三次重复。供试土壤为黄河冲积物发育的典型耕层潮土，采集于河南省农业科学院试验站（原阳，34°47′ N, 113°40′ E），深度0–20 cm。灭菌后接种T. uniseriatum菌丝块，密封后在25°C黑暗条件下培养28天。
2. 2.
   酶活性测定：采用苹果酸脱氢酶（MDH）偶联的分光光度法，在340 nm处监测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化速率，分别测定菌丝体中PEPC和PC的活性。
3. 3.
   土壤碳组分与稳定同位素分析：通过氯仿熏蒸-提取法区分并测定溶解性有机碳（DOC）和微生物生物量碳（MBC），并利用元素分析仪-稳定同位素比值质谱联用仪（EA-IRMS）测定各碳组分（SOC、DOC、MBC）的δ¹³C丰度。
4. 4.
   统计分析：运用多因素方差分析、Pearson相关性分析、主成分分析（PCA）、随机森林回归分析和偏最小二乘路径模型（PLS-PM）等方法，解析环境因子、酶活性与不同碳组分中¹³C积累之间的复杂关系。

研究结果

3.1 真菌对土壤培养系统的适应及固定¹³C的亚细胞分布

通过监测CO₂释放表征真菌适应时间，发现在接种后12–24小时内代谢活动微弱，24小时后CO₂浓度线性增加，表明真菌已适应环境进入活跃生长期。固定后的¹³C主要分布在细胞壁和细胞器中，细胞质中的¹³C富集度相对较低。

3.2 菌落直径和菌丝体固碳相关酶活性的变化

菌落直径在不同处理间差异显著。在10% CO₂系统中，当葡萄糖和Na₂S₂O₃浓度处于中等水平（100 mg·kg^?1葡萄糖，50 mg·kg^?1 Na₂S₂O₃）时菌落直径最大，表明此条件最适宜T. uniseriatum生长。多因素方差分析显示，仅葡萄糖对菌落直径有显著影响。PEPC酶活性在10% CO₂条件下随Na₂S₂O₃浓度增加而升高，其峰值出现在5% CO₂、C₁₀₀S₅₀处理。葡萄糖、Na₂S₂O₃、CO₂及其交互作用对PEPC活性均有极显著影响。PC酶活性在5% CO₂条件下显著高于10% CO₂条件，并随还原性硫浓度增加而升高，最高活性出现在5% CO₂、C₂₀₀S₁₀₀处理。所有因子及其交互作用对PC活性均有极显著影响。

3.3 不同处理下土壤碳组分的变化

在10% ¹³CO₂条件下，SOC含量略高于5% ¹³CO₂条件，峰值出现在100 mg·kg^?1葡萄糖处理。在10% CO₂、200 mg·kg^?1葡萄糖条件下，增加Na₂S₂O₃浓度促进了SOC积累。DOC含量在5% CO₂下随葡萄糖添加而逐渐降低。对于MBC，在5% CO₂下，200 mg·kg^?1葡萄糖处理的MBC含量显著高于其他处理。多变量方差分析表明，SOC含量受葡萄糖和CO₂的显著影响；葡萄糖对DOC含量有极显著主效应；葡萄糖和Na₂S₂O₃对MBC含量有显著主效应。

3.4 不同土壤碳组分间δ¹³C丰度和¹³C积累浓度的差异

不同碳组分的δ¹³C丰度差异显著，且受CO₂、葡萄糖和Na₂S₂O₃的强烈影响。总体而言，活性碳组分（DOC和MBC）的δ¹³C丰度远高于相对惰性的SOC组分，且MBC中的¹³C丰度显著高于DOC。CO₂浓度升高显著促进了接种T. uniseriatum土壤中的¹³C富集。在5% CO₂条件下，C₂₀₀S₅₀处理下的SOC和活性碳组分中观察到一个明显的¹³C富集峰，表明此时T. uniseriatum的CO₂固定效率较高。总体来看，¹³C在SOC中的积累浓度最高。

3.5 基于PCA和PLS-PM的真菌固碳驱动因素分析

相关性分析显示，PC活性与Na₂S₂O₃和DOC组分的δ¹³C呈显著正相关；PEPC活性与CO₂、Na₂S₂O₃、SOC浓度、SOC的δ¹³C丰度以及DOC呈显著正相关。随机森林模型确定了不同碳组分¹³C积累的不同预测因子集：CO₂浓度、PEPC活性、SOC含量及其δ¹³C丰度是影响SOC中¹³C积累的最重要变量；δ¹³C-DOC、δ¹³C-SOC、PC和DOC含量共同影响DOC中的¹³C积累；SOC含量、MBC含量及其δ¹³C丰度、PC和Na₂S₂O₃浓度是影响MBC中¹³C积累的主要因素。PLS-PM分析进一步表明，PC活性与活性碳库（DOC和MBC）中的¹³C积累呈正相关，而PEPC活性则主要与较稳定的SOC库中的¹³C封存相关联，这表明两种回补酶在将新固定碳导向不同土壤组分中存在功能分工。

讨论与结论总结

讨论部分指出，在本研究设置的CO₂浓度范围内，CO₂并非主要限制T. uniseriatum生长的因素，而是作为一种代谢信号或调控因子影响固碳酶活性。硫代硫酸盐的作用具有情境依赖性：在碳源受限时，它主要被用作硫源支持生长；而当碳源充足时，其角色转变为还原力供体，为CO₂固定提供能量和电子。PEPC和PC这两种回补酶对CO₂和还原性硫的响应模式相反，且能量效率不同，暗示它们存在功能分化：PEPC与土壤碳库中¹³C富集关联更紧密，而PC则在还原性硫充足、CO₂相对较低时更为重要。固定碳主要分布于真菌细胞壁，这有利于通过微生物残体积累形成稳定的SOC库。研究结论如下：综合来看，本研究表明土壤真菌T. uniseriatum在应对不同水平的CO₂、葡萄糖和硫代硫酸盐时表现出显著的代谢灵活性。在深层土壤典型的浓度范围（5–10% CO₂）内，CO₂更多地表现为一种代谢信号而非生长的首要决定因素，并与回补固碳酶PEPC和PC的活性呈现差异化关联。硫代硫酸盐的作用具有情境依赖性：在碳限制条件下，它主要与生长支持相关（可能作为硫源）；而当充足的碳源可利用时，它与增强的CO₂固定关联更密切（可能作为还原力来源）。此外，固定碳主要分布在真菌细胞壁——这种结构特征可能有利于通过微生物残体积累形成稳定的SOC库。同时，新固定碳向活性碳库（如DOC）的分配似乎与特定的酶活性（尤其是PC）相关。总之，这些发现为理解自由生活真菌的代谢可塑性及其在不同CO₂条件下与土壤碳动态的潜在相关性提供了见解。它们也提示，在未来的土壤碳过程建模工作中可能需要考虑真菌对多种相互作用环境因子的代谢响应，尽管仍需进一步研究来确定其功能机制和长期影响。