**工程化人铁蛋白纳米笼HFn-D93G增强万古霉素胞内递送及抗巨噬细胞内革兰氏阳性菌活性**

《International Journal of Nanomedicine》：Engineered Human Ferritin Nanocage Enhances Intracellular Vancomycin Delivery and Activity Against Gram-Positive Bacteria in Macrophages

　　

**摘要**

**目的** 万古霉素（Vancomycin, Van）有限的细胞膜穿透性限制了其胞内可利用性，这是治疗胞内革兰氏阳性菌感染的主要挑战。研究人员探讨了工程化铁蛋白纳米笼HFn-D93G是否能在保持Van固有抗菌活性的同时，改善其胞内递送效率。

**方法** 研究人员对HFn-D93G-Van进行了载药量、纳米笼完整性、粒径、pH依赖性释放及生物相容性表征；并通过分子对接分析Van-蛋白相互作用。在RAW264.7细胞中检测了细胞摄取、潜在摄取途径及亚细胞分布，同时在感染巨噬细胞中评估了胞内Van蓄积、与细菌的空间关联、抗菌活性及细胞因子反应。体内疗效通过小鼠金黄色葡萄球菌（S. aureus）腹膜炎-脓毒症模型（每组n = 6只）进行评价，检测了腹腔巨噬细胞胞内细菌载量、主要脏器细菌载量、血清细胞因子及组织病理学变化。

**结果** HFn-D93G-Van实现了28.71 ± 1.82%的载药量，同时保持了纳米笼形态和α-螺旋结构。48 h时，Van释放量从pH 7.4时的27.1%增加至pH 6.0时的67.4%和pH 5.0时的84.7%。最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）与游离Van相当，而胞内Van含量增加了7.34倍（P < 0.0001）。细胞摄取呈能量依赖性并涉及多种内吞途径，且与CD71相关。HFn-D93G-Van显示出与胞内细菌更强的空间关联性，并分别使S. aureus、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和屎肠球菌（E. faecium）载量降低2.00、1.62和1.76 log₁₀单位，同时细胞因子水平更低。体内实验中，与游离Van相比，腹腔巨噬细胞胞内S. aureus载量降低了0.88 log₁₀单位（P < 0.0001），而主要脏器细菌载量在Van和HFn-D93G-Van两组间相当。两种治疗后的组织病理学改变均较轻。

**结论** HFn-D93G增加了胞内Van蓄积并降低了胞内细菌载量，其胞内递送优势在体内腹腔巨噬细胞中进一步得到验证。需要进行药代动力学、生物分布、局部感染模型、免疫原性及长期安全性等进一步研究，以明确其临床前应用潜力。

**关键词**：胞内感染；糖肽类抗生素；蛋白质纳米载体；内吞摄取；抗菌药物递送

**论文解读**

**一、研究背景与问题**

胞内细菌持续存在是复发性和难治性感染治疗的主要障碍。尽管金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和屎肠球菌（Enterococcus faecium）等革兰氏阳性病原体通常被视为胞外菌，但其中部分菌株可在宿主细胞内存活，尤其S. aureus在巨噬细胞及其他宿主细胞中的胞内持久性已被充分证实。胞内细菌能够逃避免疫清除和主要作用于胞外空间的抗生素杀伤，并可适应营养限制、酸性环境等胞内应激条件，导致代谢活性降低和抗生素敏感性下降。万古霉素（Vancomycin, Van）是治疗敏感革兰氏阳性菌严重感染的重要糖肽类抗生素，其通过识别含D-Ala-D-Ala的肽聚糖前体发挥抗菌作用，但较大的分子尺寸和亲水性限制了其跨哺乳动物细胞膜的被动扩散能力。因此，常规胞外药敏试验中的Van敏感性并不一定能反映其对胞内菌的杀伤效果。针对Van胞内递送受限的问题，已有多种纳米载体策略被探索，包括颗粒工程化制剂、脂质体、pH响应性聚合物纳米颗粒、膜囊泡以及自组装纳米药物等。蛋白质纳米载体因其结构明确且可通过基因工程精确调控载药性质，具有独特优势。人H链铁蛋白（Human H-chain ferritin, HFn）由24个亚基自组装形成中空纳米笼，可与转铁蛋白受体1（Transferrin receptor 1, TfR1/CD71）结合介导细胞摄取。既往研究已鉴定HFn二重对称亚基间界面的药物进入区域，并发现Asp93至Gly的取代（D93G）可促进抗癌药物装载而无需完全解聚纳米笼。然而，铁蛋白工程策略能否在感染条件下改善胞内抗生素递送仍需进一步验证，并需在细胞水平和整体动物水平进行互补性评价。

**二、研究内容与结论**

研究人员制备了HFn-D93G-Van，系统考察了其载药量、纳米笼完整性、粒径、pH依赖性释放、细胞摄取途径、胞内外抗菌活性，并在小鼠S. aureus腹膜炎-脓毒症模型中验证了体内疗效。结果表明，HFn-D93G-Van在保持纳米笼形态和α-螺旋结构的基础上实现28.71%的载药量，释放行为呈pH依赖性（pH 5.0下48 h释放84.7%），MIC值与游离Van相当。HFn-D93G-Van显著增加了巨噬细胞胞内Van蓄积（7.34倍），降低了三种革兰氏阳性菌的胞内载量（2.00、1.62和1.76 log₁₀单位），并减轻炎症细胞因子反应。体内实验中，HFn-D93G-Van较游离Van更有效地降低腹腔巨噬细胞胞内S. aureus载量，但主要脏器细菌载量两组相当。该研究为HFn-D93G作为结构明确、可基因修饰的蛋白质纳米载体用于胞内Van递送提供了概念验证支持。其核心价值在于改善Van的细胞可及性而非增强其固有抗菌效力，未来需进一步开展药代动力学、生物分布、免疫原性和长期安全性研究。

**三、主要关键技术方法**

研究人员采用的关键技术包括：AlphaFold 3预测结构与AutoDock Vina 1.2.5分子对接分析Van与HFn-D93G通道区域的相互作用；透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）与动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）表征纳米笼形态与粒径；圆二色（Circular Dichroism, CD）光谱评估二级结构完整性；高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）定量药物装载与释放。细胞模型中，RAW264.7巨噬细胞系用于感染与摄取实验；人脐静脉内皮细胞（HUVECs）用于毒性评价。细菌菌株包括S. aureus ATCC29213、S. epidermidis ATCC35984和E. faecium ATCC19434。摄取机制采用低温孵育、药理学内吞抑制剂及抗CD71抗体分析；共定位通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）结合Pearson相关系数和阈值化Manders系数定量。体内疗效采用雌性C57BL/6小鼠S. aureus腹膜炎-脓毒症模型（每组n = 6）。

**四、研究结果**

**HFn-D93G-Van的制备与理化性质表征**
SDS-PAGE证实HFn-D93G和HFn-D93G-Van保持亚基完整性。TEM显示二者均呈球形纳米笼形态，载药后平均直径由12.70 nm增至15.30 nm。DLS测得水合动力学直径由21.09 nm增至44.85 nm，且在21天储存期间保持稳定。CD光谱显示载药后仍以α-螺旋结构为主，热稳定性分析表明两者在80°C以下保持高折叠率。HPLC定量显示在优化摩尔比1:800条件下，载药量为28.71%，每个纳米笼约负载142个Van分子。分子对接显示Van定位于HFn-D93G二重对称通道外部区域，与ARG44、LYS88、ASP46、ASP90、ASP92、TYR41、CYS91、GLU95、PHE82和LYS158等残基发生氢键、静电和疏水相互作用。释放实验显示pH 7.4下48 h累计释放27.1%，pH 6.0下为67.4%，pH 5.0下为84.7%，呈明显pH依赖释放特征。

**体外生物相容性**
MTT实验显示HFn-D93G-Van在RAW264.7细胞和HUVECs中与游离Van具有相当的细胞毒性谱，仅在长时间暴露和高浓度下出现活力下降。溶血实验显示HFn-D93G-Van在0.5–256 μM范围内溶血率均低于1%，表明具有良好的血液相容性。

**细胞摄取与胞内分布分析**
流式细胞术显示AF647标记的HFn-D93G-Van在RAW264.7细胞中呈浓度依赖性摄取，4°C条件下摄取降至约9.3%，氯丙嗪处理后降至14.1%，渥曼青霉素处理后降至6.6%，抗CD71抗体处理后降至46.7%，而染料木黄酮处理无显著影响，表明摄取过程能量依赖，涉及网格蛋白相关内吞、PI3K相关巨胞饮及CD71相关途径。CLSM显示纳米颗粒主要分布于细胞质中，与溶酶体部分共定位，载药前后溶酶体共定位程度无显著差异。

**与胞内革兰氏阳性菌的空间关联分析**
在S. aureus、S. epidermidis和E. faecium感染的RAW264.7细胞中，HFn-D93G-Van与FITC标记细菌的Pearson相关系数和tM1系数均显著高于空载HFn-D93G，表明载药纳米笼与胞内细菌具有更强的空间重叠性。

**胞内抗菌活性与细胞因子反应**
MIC实验表明HFn-D93G-Van对S. aureus ATCC29213的MIC为0.5 μM，对S. epidermidis和E. faecium均为1 μM，与游离Van相当。胞内杀菌实验显示HFn-D93G-Van在32 μM剂量下使S. aureus、S. epidermidis和E. faecium胞内载量分别降低2.00、1.62和1.76 log₁₀单位，较游离Van分别降低约82、23和49倍。ELISA检测显示HFn-D93G-Van显著降低三种感染模型中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平，且均低于游离Van组。

**体内疗效评价**
在小鼠S. aureus腹膜炎-脓毒症模型中，HFn-D93G-Van使腹腔巨噬细胞胞内细菌载量较对照组降低1.03 log₁₀单位，较游离Van组进一步降低0.88 log₁₀单位（P < 0.0001），而游离Van相对于对照组无显著效果。主要脏器（肝、脾、肾、肺）细菌载量方面，Van和HFn-D93G-Van均显著低于对照组，但两治疗组间无显著差异。两种治疗均显著降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平。组织病理学显示两治疗组的感染相关改变均较对照组和空载HFn-D93G组轻微。

**五、讨论与结论总结**

讨论中指出，HFn-D93G-Van的核心递送优势在于增加巨噬细胞胞内Van蓄积，而非改变Van固有抗菌活性。分子对接提示Van可能结合于纳米笼二重对称通道的表面近端区域，但该模型仅代表一种可能的结合构型。释放数据表明，Van在酸性条件下释放增加，但胞内释放程度未直接测得。细胞摄取涉及多种内吞途径，而非单一主导途径。共定位分析显示载药纳米笼与胞内细菌空间关联增加，但该数据反映空间重叠而非直接结合。体内结果显示，胞内递送优势集中体现在腹腔巨噬细胞中，而非整体器官细菌载量，符合该制剂针对细胞可及性障碍的设计初衷。结论部分指出，HFn通过改善Van的细胞可及性增强其胞内抗菌效果，为铁蛋白纳米笼在胞内感染治疗中的进一步开发提供了概念验证支持。