负载槲皮素/人参皂苷Rg3的磷酸钙纳米平台（R-LCP/Q）缓解乳腺癌相关外周痛觉过敏并增强抗肿瘤免疫

《International Journal of Nanomedicine》：A Quercetin/Rg3-Loaded Calcium Phosphate Nanoplatform Alleviates Breast Cancer-Induced Peripheral Hyperalgesia and Enhances Antitumor Immunity

　　

目的：本研究旨在研发一种多功能纳米平台Rg3-Lip-CaPO₄/Quercetin（R-LCP/Q），用于整合抗肿瘤治疗、免疫调节和癌症疼痛缓解。方法：研究人员通过将人参皂苷Rg3（ginsenoside Rg3）掺入负载槲皮素（quercetin，Que）的脂质包覆磷酸钙（CaPO₄）纳米平台中构建R-LCP/Q。对其理化性质、pH响应释放、细胞摄取、抗肿瘤活性、Ca²⁺相关细胞内效应、免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）、免疫调节、生物分布、生物安全性及镇痛效果在体外和4T1乳腺癌相关疼痛模型中进行了评估。研究人员进一步利用选择性瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）拮抗剂AMG9810评估了TRPV1信号在镇痛中的参与。结果：R-LCP/Q在酸性条件下表现出pH响应性降解及Ca²⁺、Que和Rg3的释放，并在Rg3功能化后增强细胞摄取和肿瘤相关蓄积。R-LCP/Q诱导细胞内Ca²⁺蓄积、线粒体去极化、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成和肿瘤细胞凋亡；这些效应可被细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA显著减弱，支持细胞毒性反应中Ca²⁺依赖性的重要贡献。R-LCP/Q还增加ICD相关标志物，并促进树突状细胞（dendritic cells，DCs）成熟。在体内，R-LCP/Q抑制肿瘤生长，并与DCs成熟增强、CD8⁺ T细胞反应增加、M1样巨噬细胞表型转变、调节性T细胞频率降低以及肿瘤相关TNF-α和IL-6水平降低相关。R-LCP/Q还缓解机械性和热性痛觉过敏，伴随背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）中TRPV1表达降低和血清P物质（substance P，SP）水平降低；TRPV1药理阻断剂AMG9810也产生镇痛反应。短期血液学、生化、组织学和血液相容性评估显示良好的耐受性。结论：R-LCP/Q为整合肿瘤抑制、抗肿瘤免疫调节和癌症疼痛缓解的多功能纳米治疗策略提供了临床前概念验证。研究结果支持进一步研究肿瘤-免疫-伤害性感受的协调调控作为癌症治疗的一种方法。

癌症因高发病率和高死亡率成为全球重大公共卫生挑战。除肿瘤进展本身外，癌症相关疼痛显著损害患者生活质量，尤其晚期患者。癌痛机制复杂，包括肿瘤压迫、局部炎症缺血和外周伤害性通路异常激活。传统治疗侧重肿瘤控制，同时管理肿瘤进展和疼痛仍不充分。肿瘤与感觉神经存在双向交互，TRPV1是初级传入感觉神经元高表达的伤害性离子通道，可被热、化学和炎性刺激激活，促进SP等神经肽释放，参与疼痛敏化和肿瘤进展。槲皮素（Que）有抗肿瘤、抗炎和镇痛作用，但水溶性差、生物利用度低。钙磷酸盐纳米颗粒（CaPO₄ NPs）具有良好生物相容性、生物降解性和酸敏感溶解性，可在酸性条件释放Ca²⁺。人参皂苷Rg3具有抗肿瘤和免疫调节活性，可作为脂质膜结构成分。因此，研究人员开发了Rg3功能化脂质包覆磷酸钙纳米平台共载Que（R-LCP/Q），旨在整合肿瘤抑制、免疫调节和癌痛缓解。

研究人员构建了R-LCP/Q纳米平台，通过理化表征、pH响应释放实验、细胞实验和4T1乳腺癌相关疼痛模型，系统评估了其抗肿瘤活性、Ca²⁺相关细胞内效应、免疫原性细胞死亡（ICD）、免疫调节、镇痛效果和安全性。结果表明，R-LCP/Q在酸性环境释放Ca²⁺、Que和Rg3，增强细胞摄取和肿瘤蓄积，诱导Ca²⁺依赖的线粒体损伤和ICD，促进DC成熟和CD8⁺ T细胞免疫，缓解机械和热痛觉过敏，且短期耐受性良好。

主要技术方法：R-LCP/Q通过反向微乳液法合成CaPO₄核心，再以含Rg3和DSPE-PEG5k的脂质膜包覆，并负载Que。利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）等表征理化性质；通过不同pH的PBS评估释放行为。细胞摄取使用罗丹明B（RhB）标记和D-葡萄糖竞争实验。动物模型为4T1细胞足底注射至雌性BALB/c小鼠建立的肿瘤相关疼痛模型，采用瘤内注射治疗。免疫细胞分析采用流式细胞术，细胞因子和SP用ELISA，TRPV1和CD8用免疫荧光，行为学测试评估机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）。安全性通过血液学、生化、组织学和溶血实验评估。

结果部分：

合成与表征：DLS显示R-LCP/Q平均粒径为124.7±3.24 nm，TEM示球形形貌，XPS证实元素组成，Que包封率83.25%，载药量32.15%。

体外酸响应解离与药物释放：在pH 5.5下，Ca²⁺、Que、Rg3的累积释放分别达69.76%、71.34%、85%，pH 7.4下释放较低，TEM显示酸性条件引起结构破坏。

细胞摄取与肿瘤分布：R-LCP/Q较LCP/Q显著增强4T1细胞摄取，D-葡萄糖竞争抑制摄取，且RhB标记的R-LCP/Q与GLUT-1荧光共定位；体内成像显示R-LCP/Q肿瘤蓄积更强。

细胞内Ca²⁺蓄积与线粒体功能障碍：R-LCP/Q增强Fluo-4 AM荧光，BAPTA预处理减弱此信号；JC-1染色显示线粒体膜电位下降，BAPTA抑制该变化；DCFH-DA