性别依赖性膳食α-酮戊二酸调节肺腺癌生长与表观遗传重塑

《Cell Reports》：Dietary α-ketoglutarate modulates lung adenocarcinoma growth and epigenetic remodeling in a sex-dependent fashion

　　

肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是最常见的肺癌类型，也是癌症相关死亡的主要原因，凸显了开发新型化学预防策略的迫切性。α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, αKG）是三羧酸循环代谢物和双加氧酶辅因子，将细胞代谢与染色质调控联系起来。本研究表明，膳食补充钙α-酮戊二酸（calcium αKG, Ca-αKG）与LUAD的性别依赖性重塑相关。在雌性小鼠中，Ca-αKG与肿瘤面积减少、抑制性组蛋白标记（H3K27me3和H3K9me3）降低以及TBX5和肌生成相关基因上调相关。在雄性小鼠中，Ca-αKG与肿瘤面积增加和H3K27me3升高相关。对人类LUAD的分析显示，TBX5表达在女性肿瘤中富集，并与更好的生存率相关，提示其可能作为良好预后的标志物。综上，这些发现支持Ca-αKG作为一种表观遗传调节剂，具有肺癌化学预防潜力，并强调了将性别作为生物学变量纳入临床前研究的重要性。

**研究背景与目标**

肺癌仍是全球癌症相关死亡的首要原因，尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，五年生存率仍较低。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是最常见的肺癌组织学类型，KRAS激活突变（尤其是G12D等位基因）是最常见的致癌驱动因素之一，并驱动代谢重编程。代谢干预（包括饮食和药理学方法）正在多种癌症的临床试验中接受测试。α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, αKG）是三羧酸循环的中央代谢物，也是αKG依赖性双加氧酶的必需辅因子，参与组蛋白、DNA和RNA脱甲基化等多种细胞过程，从而将细胞代谢与基因调控联系起来。既往研究显示αKG可增强干细胞多能性、调节免疫反应并影响癌细胞可塑性，但其对KRAS驱动LUAD肿瘤生长和表观遗传状态的体内影响仍 largely 未被探索。本研究旨在利用Kras^LSL-G12D/+驱动的基因工程小鼠模型，探究膳食钙αKG（calcium αKG, Ca-αKG）补充对LUAD肿瘤生物学的影响。

**研究内容与主要结论**

研究人员发现膳食Ca-αKG补充对LUAD肿瘤生长具有性别依赖性效应：在雌性小鼠中显著降低肿瘤面积和增殖，而在雄性小鼠中则增加肿瘤面积和增殖。转录组分析显示，Ca-αKG仅在雌性肿瘤中显著富集肌生成（myogenesis）通路，而在雄性肿瘤中该通路被抑制。通过转录因子富集分析、免疫组织化学和体外实验，研究人员鉴定出Tbx5是雌性肿瘤中与肌生成程序相关的关键转录因子，且αKG足以在女性来源的LUAD细胞系中诱导TBX5表达。在表观遗传层面，Ca-αKG在雌性肿瘤中降低抑制性组蛋白标记H3K27me3和H3K9me3，而在雄性肿瘤中升高H3K27me3；代谢组学分析显示肿瘤生物能量状态无显著变化。人类TCGA-LUAD数据分析表明，TBX5在女性肿瘤中表达更高，高TBX5表达与女性患者更好的五年总生存率相关，且与分化标志物正相关、与增殖标志物负相关。此外，在Kras^LSL-G12D/+; Trp53^flox/flox（KP）小鼠中，Ca-αKG的抗肿瘤效应消失，提示Tp53是Ca-αKG效应的关键决定因素；人类数据也显示TP53突变型肿瘤中TBX5表达更低，且TBX5的预后价值主要体现在TP53突变型肿瘤中。这些发现确立了Ca-αKG作为一种表观遗传活性化合物在LUAD中的潜在化学预防价值，并强调了性别和肿瘤基因型是必须纳入临床前研究的关键生物学变量。

**研究采用的主要技术方法**

研究人员使用了C57BL/6J背景的Kras^LSL-G12D/+条件性基因工程小鼠模型，通过鼻内滴注表达Cre重组酶的腺病毒（AdCre）诱导LUAD发生，随机分为对照饮食组和2%（w/w）Ca-αKG补充饮食组，喂养16周后取材分析。细胞实验采用女性来源（H1975、HCC827）和男性来源（A549、H358）的人类LUAD细胞系，在无类固醇培养基及低糖条件下用细胞通透性αKG衍生物dm-αKG处理。主要技术包括：H&E染色和多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）评估肿瘤负荷与增殖；bulk RNA测序及基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）和ChEA3转录因子富集分析；免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测Tbx5和Gata4表达并计算H-score；Western blot检测组蛋白甲基化修饰水平；液相色谱-质谱联用（LC-MS）非靶向代谢组学分析；以及利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）LUAD队列进行生存分析和相关性分析。

**研究结果**

**1. 饮食αKG以性别依赖性方式改变LUAD小鼠的肿瘤生长**

通过H&E染色定量肿瘤面积，发现对照饮食下雌性小鼠肿瘤面积有大于雄性的趋势（p = 0.06）。在雌性小鼠中，Ca-αKG显著降低肿瘤面积（p = 0.05）；而在雄性小鼠中，Ca-αKG显著增加肿瘤面积（p = 0.02）。多重免疫荧光分析显示，Ca-αKG在雌性中显著降低肿瘤细胞增殖（p = 0.05），在雄性中显著增加增殖（p = 0.0025）。肿瘤多发性的数量在两种性别中均无变化，提示Ca-αKG主要影响肿瘤生长而非肿瘤起始。

**2. 饮食αKG在雌性肿瘤中诱导肌生成转录程序**

bulk RNA-seq分析显示，Ca-αKG处理后，肌生成是雌性肿瘤中唯一显著富集的通路（NES = 1.57；FDR q < 0.001），在雄性中该通路被显著抑制（NES = ?0.93；FDR q < 0.001）。热图和火山图显示Mybpc3、Actn2、Hrc、Tnnt2、Tnnc1、Myom1、Myom2、Fabp3、Ldb3和Tnnt1等肌生成相关基因在雌性肿瘤中被诱导。RT-qPCR验证了Fabp3、Myom2和Sgcg在雌性肿瘤中显著上调，而雄性肿瘤反应减弱或相反。

**3. Tbx5与αKG处理的雌性LUAD肿瘤中肌生成转录程序相关**

ChEA3转录因子富集分析将Tbx5和Gata4列为肌生成前缘基因的候选上游调节因子。IHC显示Ca-αKG在雌性肿瘤中显著增加Tbx5核表达（p = 0.0009），在雄性中降低其表达（p = 0.0004）；Gata4在雌性中无变化，在雄性中显著升高（p = 4.65 × 10^?8）。基线水平上，雄性肿瘤Tbx5更高，雌性肿瘤Gata4更高。体外实验中，dm-αKG在女性来源的LUAD细胞（H1975和HCC827）中显著诱导TBX5表达，而男性来源细胞（A549和H358）无诱导或呈下降趋势，且在无性类固醇培养基中仍成立，提示该效应具有肿瘤内在性。

**4. 饮食αKG以性别依赖性方式改变抑制性组蛋白甲基化**

Western blot分析组蛋白提取物显示，在雌性肿瘤中Ca-αKG显著降低H3K27me3（p = 0.05）和H3K9me3（p = 0.04），H3K4me3呈下降趋势但未达显著；在雄性肿瘤中Ca-αKG显著升高H3K27me3（p = 0.002），H3K4me3和H3K9me3无显著变化。非靶向代谢组学显示糖酵解和三羧酸循环代谢物、ADP、AMP和NAD⁺水平均无显著改变，提示Ca-αKG的主要作用并非生物能量效应。

**5. TBX5表达与人类LUAD的分化、增殖标志物及预后相关**

TCGA-LUAD队列分析显示，TBX5在女性肿瘤中的表达显著高于男性（p = 0.035）。Kaplan-Meier生存分析显示，高TBX5表达与女性患者更好的五年总生存率显著相关（p = 0.03），在男性中呈相似但非显著趋势（p = 0.30）。Cox比例风险模型确认低TBX5表达在女性中预测较差生存（HR = 1.58；p = 0.03），男性中未达显著（HR = 1.28；p = 0.30）。TBX5表达与肌生成基因MYOM2和FABP3、分化标志物FOXA2正相关，与增殖标志物MKI67和CDK1强负相关。相比之下，GATA4高表达仅在女性患者中与较差的五年生存率相关（p = 0.046）。

**6. 膳食Ca-αKG的效应依赖于TP53状态**

在Kras^LSL-G12D/+; Trp53^flox/flox（KP）小鼠中，Ca-αKG在雌性或雄性中均未显著改变肿瘤生长（雌性p = 0.069，雄性p = 0.434）。TCGA数据显示，TP53突变型LUAD中TBX5表达显著低于TP53野生型（WT）肿瘤（p < 0.0001）。按TP53状态分层分析显示，高TBX5表达带来的生存优势主要存在于TP53突变型肿瘤中，而在TP53野生型中不显著。

**讨论总结与研究结论**

该研究首次报道了膳食Ca-αKG补充对LUAD组蛋白甲基化、转录编程和肿瘤生长的性别依赖性效应，确立了性别作为代谢干预反应的关键生物学决定因素。Ca-αKG在雌性中降低抑制性组蛋白标记并诱导肌生成相关谱系程序，在雄性中则增强抑制性标记，其机制可能涉及X连锁H3K27脱甲基酶KDM6A的性别偏向活性，但需要直接验证。代谢组学结果支持Ca-αKG在该模型中的主要作用是表观遗传性而非代谢性。TBX5被鉴定为与分化程度更高、增殖更低的LUAD状态相关的性别偏向转录因子。Tp53状态被证明是Ca-αKG效应的关键决定因素：Tp53缺失使抗肿瘤效应消失，且人类TP53突变型肿瘤中TBX5的预后价值更明显。

研究结论：膳食Ca-αKG是一种候选的代谢-表观遗传干预策略，其抗肿瘤效应具有性别依赖性和Tp53依赖性。该研究强调，代谢干预的生物学后果强烈依赖于性别和肿瘤基因型，将性别和基因型纳入基于代谢的癌症预防和治疗策略的开发具有重要意义。研究局限性包括：未表征组蛋白标记在染色质上的全基因组分布动态变化、未评估Ca-αKG的系统性效应、缺乏组蛋白脱甲基酶和Tbx5的敲除验证，以及αKG与不同TP53突变体的相互作用有待深入阐明。