维生素C发酵副产物通过调节抗坏血酸氧化还原状态并增强抗氧化防御能力提高小白菜耐冷性

《Agriculture》：A Vitamin C Fermentation By-Product Enhances Chilling Tolerance in Pak Choi by Modulating Ascorbate Redox Status and Augmenting Antioxidant Defense Capacity

　　

摘要专业翻译 早春低温胁迫扰乱氧化还原平衡并限制叶菜类蔬菜的生长。本研究旨在探究蒸发残渣（residue after evaporation，RAE）——一种维生素C发酵副产物——能否提高小白菜的耐冷性，以及其效果是否因施用方式和与KH2PO4共施而有所不同。试验设对照（CK）、叶面喷施0.2% KH2PO4（KP）、叶面或根区施用RAE（Rf和Rr）及其RAE+KH2PO4组合处理（Rf-KP和Rr-KP）。研究人员分别在处理后24 h、低温胁迫前（T1）、4 °C处理48 h后（T2）以及低温胁迫后恢复生长72 h后（T3）对植株进行评估。在T1时期，含RAE的处理使抗坏血酸（ascorbate，AsA）含量提高13.91%–26.16%，AsA/脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）比值提高17.08%–32.90%，而此时尚未检测到生长或氧化损伤方面的差异。在T2时期，含RAE的处理使AsA含量和AsA/DHA比值分别提高25.58%–49.38%和38.52%–69.13%，增强了抗氧化防御能力，并减轻了低温伤害、叶片损伤和过氧化氢积累。根活力在Rr和Rr-KP处理下分别提高25.40%和39.37%。在T3时期，所有处理使地上部鲜重提高22.71%–109.05%，受损叶片率降低42.40%–71.24%。Rf-KP和Rr-KP在T2和T3时期均获得最高的综合耐冷性评分。该评分在T2时期存在显著的RAE × KH2PO4交互效应，但在T3时期不显著。两种RAE施用方式均能提高耐冷性。抗坏血酸氧化还原状态的早期变化先于后续胁迫响应，而RAE × KH2PO4的交互效应因性状和阶段而异。这些发现支持将RAE作为改善叶菜类蔬菜耐冷性的潜在农业投入品进行进一步评估。

论文解读文章

一、研究背景与目的

低温胁迫是制约叶菜类蔬菜春季稳产的重要环境因素，即使在冷季型蔬菜中也可能造成显著产量损失。例如，结球莴苣在4 °C下暴露7天，鲜重较20 °C对照降低约29%；根区温度从20 °C降至10 °C一周，可使青花菜的可销售产量降低18.9%。早春持续或间歇性低温可导致叶片黄化、膜完整性丧失和生长抑制，并可能在温度恢复后对叶片更新和生物量积累产生持续影响。细胞氧化还原稳态的破坏是低温伤害的重要组成部分——低温限制光合碳同化和正常代谢过程时，活性氧（reactive oxygen species，ROS）可能过度积累，导致膜脂过氧化加剧、膜透性增加和代谢功能紊乱。耐冷性不仅与胁迫期间控制ROS积累和膜损伤的能力有关，还与胁迫前建立的氧化还原状态以及低温后维持生长的能力密切相关。

磷酸二氢钾（KH₂PO₄）作为叶面磷钾补充剂广泛用于作物生产，也常在预期低温事件前施用。磷和钾参与能量与碳代谢、渗透调节、离子稳态和膜功能维持。然而，KH₂PO₄诱导的生理响应可能因作物种类、低温强度、养分状况和施用时机而异，单纯补充养分可能无法全面应对低温胁迫的多方面生理响应。因此，将具有不同生理特性的外源调控物质纳入现有基于KH₂PO₄的管理体系，可能为改善叶菜类蔬菜耐冷性提供额外途径。

抗坏血酸（ascorbate，AsA）是植物细胞中重要的水溶性抗氧化剂，也是维持细胞氧化还原稳态的关键代谢物。AsA直接参与ROS清除，并在过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）还原H₂O₂过程中充当电子供体。其氧化形式脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）可通过抗坏血酸再生系统还原为AsA。因此，AsA含量和AsA/DHA比值是抗坏血酸系统氧化还原状态的有效指标。已有研究表明，内源AsA水平升高或AsA再生增强与耐冷性及其他非生物胁迫耐受性改善相关。此前有研究报道2-酮-L-古洛糖酸（2-keto-L-gulonic acid，2KGA）可在低温前提高内源AsA，但该增加伴随胁迫前植株生长的改善，使得难以区分AsA状态改变与既有生长优势对后续低温响应的贡献。

蒸发残渣（residue after evaporation，RAE）是工业维生素C发酵的副产物，含有多种低分子量有机酸，包括2KGA（15–25%）、乙酸（1–3%）和草酸（1–2%）。2KGA是工业维生素C生产的重要前体，外源2KGA已被报道可促进AsA积累并在逆境条件下改善抗氧化响应。RAE也显示出促进作物生长和改善胁迫响应的潜力，其农业利用为维生素C发酵残渣的资源化提供了额外途径。然而，关于RAE仍有关键问题未解：AsA氧化还原状态的变化能否在植株生长出现明显差异之前发生，这些早期变化是否与后续持续低温期间的抗氧化防御和组织损伤相关；叶面施用和根区施用是否产生不同的生理响应；以及RAE与KH₂PO₄组合使用时相对于单独处理的表现如何。

基于RAE和2KGA与AsA积累相关的既有证据以及AsA在植物低温响应中的作用，研究人员假设RAE能在低温前改变AsA氧化还原状态，且这些早期变化与后续持续低温耐受性的改善相关；进一步假设RAE的响应可能因施用方式而异，其与KH₂PO₄的组合可能改善低温条件下植株的整体表现。本研究以小白菜（Brassica rapa L. subsp. chinensis）为材料，采用叶面或根区施用RAE（单独或与KH₂PO₄组合），旨在：（1）确定RAE是否在低温前诱导可检测的生理变化，特别是AsA氧化还原状态的变化；（2）表征其在持续低温期间对氧化还原状态、抗氧化防御、膜损伤和叶片生理性状的影响；（3）评估这些效应在后续生长期间是否仍然明显；（4）比较叶面和根区RAE施用（单独及与KH₂PO₄组合）对耐冷性的影响。

二、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定AsA和总抗坏血酸含量，DHA经二硫苏糖醇还原后间接测定；分光光度法测定叶绿素、类胡萝卜素、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢（H₂O₂）、可溶性糖含量及电解质外渗率；酶活性测定包括单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）、APX、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）还原法测定根活力；基于主成分分析（PCA）的降维加权法计算综合耐冷性评分；双因素方差分析和计划对比检验处理效应与交互作用；线性回归、Spearman相关和Mantel检验用于综合分析性状间关联。实验在中国科学院沈阳应用生态研究所可控环境植物生长室内进行，供试小白菜品种为‘四季小白菜’（寿禾牌），种子购自山东寿禾种业有限公司。

三、研究结果

3.1 RAE和KH₂PO₄处理对低温胁迫前小白菜生理状态的影响

处理前（T0）各处理间叶片SPAD、REC、AsA和MDA无显著差异，表明初始生理状态均匀。处理后24 h、低温胁迫前（T1），SPAD、根活力、REC、DHA、MDHAR、DHAR、GR、可溶性糖、MDA和H₂O₂均无显著处理效应，株高、鲜重和叶片数也无显著差异。然而，所有含RAE的处理显著提高了AsA含量和AsA/DHA比值：相对CK，AsA含量在Rf、Rr、Rf-KP和Rr-KP下分别提高21.06%、13.91%、26.16%和17.15%，AsA/DHA比值分别提高26.43%、17.08%、32.90%和20.85%。Rf-KP在AsA含量和AsA/DHA比值上增幅最大，而KP单独处理与CK无显著差异。双因素方差分析显示RAE对AsA和AsA/DHA有显著主效应（均p < 0.001），KH₂PO₄主效应不显著，未检测到RAE × KH₂PO₄交互效应。这表明低温前的抗坏血酸氧化还原状态变化主要与RAE处理相关。

3.2 RAE处理减轻了小白菜的低温伤害并增强了抗氧化防御

在4 °C持续低温48 h后（T2），RAE显著减轻了小白菜叶片的低温伤害和膜损伤。相对CK，低温伤害指数（chilling injury index，CII）在Rf、Rr、Rf-KP和Rr-KP下分别显著降低26.67%、22.22%、48.89%和37.78%，Rf-KP降幅最大。各RAE处理使REC显著降低18.70%–32.70%，MDA降低7.38%–13.76%，H₂O₂降低3.73%–10.14%。KP单独处理在这三项指标上与CK无显著差异。双因素方差分析显示RAE和KH₂PO₄对CII、REC、MDA和H₂O₂均有显著主效应，但未检测到显著交互效应。

T2时期各处理在叶片色素性状和可溶性糖含量上出现明显差异。与CK相比，所有处理均显著提高SPAD、叶绿素a（Chla）、Chla/Chlb比值、总叶绿素（Chlab）、Chlab/类胡萝卜素比值和可溶性糖含量。Chlb在所有处理（KP除外）下均显著增加。组合处理普遍表现出较高值：Rf-KP和Rr-KP分别使SPAD提高36.93%和34.41%，Chlab提高15.68%和14.00%，可溶性糖含量提高38.24%和40.17%。类胡萝卜素含量在各处理间无显著差异。根活力仅在根区施用RAE的处理下显著提高，Rr和Rr-KP相对CK分别提高25.40%和39.37%。双因素方差分析检测到SPAD存在显著的RAE × KH₂PO₄交互效应（p < 0.001），其中叶面施用的计划对比显著而根区施用的不显著。

T2时期含RAE的处理显著影响了AsA氧化还原系统，而KP单独处理在AsA、DHA、AsA/DHA比值、MDHAR、DHAR和GR上与CK无显著差异。相对CK，AsA含量在Rf、Rr、Rf-KP和Rr-KP下分别显著提高25.58%、29.51%、49.38%和39.87%，DHA显著降低8.79%–11.10%，AsA/DHA比值分别显著提高38.52%、42.56%、69.13%和57.86%。Rf-KP的AsA含量最高，两个组合处理的AsA/DHA比值最高。MDHAR活性在各处理间无变化。DHAR活性在四个含RAE处理下分别显著提高24.44%、22.85%、46.70%和43.18%，GR活性分别提高44.10%、68.34%、62.20%和89.14%。双因素方差分析检测到AsA（p = 0.004）和DHAR（p = 0.038）存在显著的RAE × KH₂PO₄交互效应，其中AsA的交互效应主要体现在叶面施用，DHAR的叶面和根区计划对比均显著。

KP单独处理在T2时期对APX、CAT、POD和SOD活性无显著影响，而所有含RAE的处理均显著提高这些酶活性。相对CK，APX、CAT、POD和SOD活性分别提高13.45%–27.09%、9.04%–32.16%、6.32%–17.24%和5.67%–18.94%。CAT活性在Rf-KP下最高（提高32.16%），APX、POD和SOD在Rr-KP下最高（分别提高27.09%、17.24%和18.94%）。双因素方差分析仅在SOD上检测到显著的RAE × KH₂PO₄交互效应（p < 0.001），叶面和根区计划对比均显著。

3.3 RAE和KH₂PO₄处理改善了小白菜低温后的生长和生理状态

在低温处理后正常条件下恢复生长72 h（T3），各处理间在植株生长和叶片生理状态上出现明显差异。与CK相比，株高、根长、地上部鲜重和地上部干重分别显著提高13.91%–23.92%、21.42%–66.18%、22.71%–109.05%和20.62%–94.03%，组合处理通常表现出更大的响应。

地下部生物量呈现处理特异性响应。KP和Rf分别使地下部鲜重显著降低15.43%和23.29%，KP使地下部干重降低41.50%。相反，Rr、Rf-KP和Rr-KP使地下部鲜重显著提高10.64%–53.93%，干重提高15.99%–44.90%，Rr-KP最高。双因素方差分析检测到地下部鲜重、地下部干重和根冠比存在显著的RAE × KH₂PO₄交互效应（均p < 0.001）。根冠比在KP、Rf、Rr和Rf-KP下显著降低26.29%–51.44%，而Rr-KP与CK无显著差异。

所有处理均显著增加总叶片数和新叶数，减少受损叶片数。新叶比例显著提高213.12%–400.67%，受损叶片率显著降低42.40%–71.24%，组合处理响应最强。受损叶片率检测到显著的RAE × KH₂PO₄交互效应（p < 0.001）。

此外，所有处理均显著改善了低温后恢复期的叶片生理状态。与CK相比，SPAD值提高12.27%–31.21%，REC和MDA含量分别降低22.47%–60.46%和11.09%–46.06%。SPAD在Rf-KP下最高，Rr-KP的REC和MDA水平最低。SPAD存在显著的RAE × KH₂PO₄交互效应（p < 0.001），REC和MDA的交互效应不显著。

3.4 小白菜低温胁迫响应的综合分析

T2时期线性回归分析显示，AsA含量与DHAR活性和SPAD呈正相关（R2 = 0.850和0.738，p < 0.001），与H₂O₂含量和CII呈负相关（R2 = 0.531和0.421，p < 0.001）。Spearman相关分析显示，AsA、AsA/DHA比值、CAT、POD和SOD与APX、DHAR和GR显著正相关，DHA与这些酶显著负相关，MDHAR无显著相关。处理因素中，RAE_根区与APX和GR显著正相关，RAE_叶面仅与DHAR显著正相关，KH₂PO₄与四种抗氧化酶均无显著相关。Mantel检验显示，AsA、AsA/DHA比值和抗氧化酶性状与低温诱导的氧化和膜损伤及光合色素状态均显著相关。RAE_叶面与低温诱导的氧化和膜损伤显著相关，KH₂PO₄与光合色素状态显著相关。

T2时期层级聚类将CK和KP与含RAE的处理分开。Rf-KP和Rr-KP表现出相似响应模式，损伤相关性状较低，抗氧化、AsA相关和色素性状较高。T2综合耐冷性评分在Rf-KP和Rr-KP下最高且两者无显著差异，其次为Rr、Rf、KP和CK。T2综合评分的RAE × KH₂PO₄交互效应显著（p < 0.001），叶面和根区计划对比均显著。

T3时期层级聚类同样显示各处理间存在不同响应模式。Rf-KP和Rr-KP紧密聚类，受损叶片率、REC和MDA较低，生长和叶片相关性状普遍高于CK。T3综合耐冷性评分在Rr-KP和Rf-KP下最高且无显著差异，其次为Rr、Rf、KP和CK。但T3综合评分的RAE × KH₂PO₄交互效应不显著（p = 0.057）。

四、讨论总结与研究结论

本研究表明，RAE在低温前诱导了AsA氧化还原状态的改变——AsA含量和AsA/DHA比值显著升高，而生长、氧化损伤和抗氧化酶活性尚未出现可检测的变化。这种时间序列将早期抗坏血酸响应与后续低温响应联系起来，但尚不能确立因果关系。低温期间，含RAE的处理表现出更高的DHAR和GR活性、更强的抗氧化酶防御以及更低的H₂O₂、MDA、REC和CII，表明RAE有效限制了低温诱导的氧化损伤及其向膜破坏和可见叶片损伤的进展。低温后恢复期，含RAE的处理在植株生长、新叶形成和受损叶片减少方面表现更佳，表明处理差异在低温期间建立并在后续生长中持续显现。

KH₂PO₄单独处理在AsA氧化还原系统和抗氧化酶方面未显示显著效应，但在叶片色素、可溶性糖和低温后生长方面表现出改善。RAE与KH₂PO₄的差异不在于调控完全独立的生理过程——KH₂PO₄诱导的色素、可溶性糖和后续生长性状改善仍是耐冷性的重要组成部分，而RAE额外引发了更强的AsA氧化还原调控和抗氧化防御。双因素分析显示RAE × KH₂PO₄交互效应具有性状依赖性和阶段依赖性：T2时期在SPAD、AsA、DHAR、SOD和综合耐冷性评分上检测到显著交互，而CII、REC、MDA和H₂O₂等损伤相关性状仅显示显著主效应而无交互；综合评分的交互在T2显著而在T3不显著。

叶面和根区施用RAE均能改善小白菜耐冷性，但两种施用方式在若干生理过程和器官响应上存在差异。叶面施用与叶片氧化和膜损伤相关性状的变异显著相关，并与DHAR正相关；根区施用与APX和GR正相关，且仅根区处理显著提高根活力。叶面施用与叶片氧化还原和抗氧化性状的显著变化相关，根区施用则在根活力和地下部生长方面表现出独特响应。两种施用方式在T2和T3的综合耐冷性评分上无显著差异，表明总体耐冷性表现相似，尽管生理和器官水平响应模式有所不同。

研究结论：本研究证明在可控条件下，RAE能提高小白菜的耐冷性。低温前，RAE提高了叶片AsA含量和AsA/DHA比值，这些变化先于后续抗氧化和损伤响应，但尚不能确立因果机制。低温期间，含RAE的处理表现出更高的AsA再生和抗氧化酶活性以及更低的H₂O₂、MDA、REC和低温伤害指数。低温后的生长和叶片更新也普遍改善。叶面和根区施用RAE均有效。双因素分析显示RAE × KH₂PO₄交互效应具有性状和阶段依赖性而非统一模式。组合处理具有较高的综合耐冷性评分，但该评分的交互效应在T2显著而T3不显著。在实际应用前，需进一步研究RAE的组成、剂量响应、安全性和田间表现。