《Cell Reports》：Placental trophoblasts exhibit iron dysregulation and ferroptosis signaling associated with SARS-CoV-2 restriction
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产前SARS-CoV-2感染与不良妊娠结局相关，但塑造胎盘病毒传播和损伤的机制尚不清楚。研究人员证明，SARS-CoV-2在胎盘中诱导与铁死亡相关的铁失调，可能是限制滋养层细胞感染的潜在尝试。来自孕早期感染个体的胎盘在足月时表现出持续的病毒蛋白表达、铁积累、铁
产前SARS-CoV-2感染与不良妊娠结局相关，但塑造胎盘病毒传播和损伤的机制尚不清楚。研究人员证明，SARS-CoV-2在胎盘中诱导与铁死亡相关的铁失调，可能是限制滋养层细胞感染的潜在尝试。来自孕早期感染个体的胎盘在足月时表现出持续的病毒蛋白表达、铁积累、铁转运蛋白定位破坏以及铁死亡抑制剂谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达降低。在滋养层细胞和具有顶侧向外极性的干细胞来源滋养层类器官中，SARS-CoV-2 Delta变异株抑制铁外排转运蛋白ferroportin及铁死亡抑制剂GPX4和VIA族磷脂酶A2（PLA2G6）的表达，促进铁死亡信号传导。药理学激活铁死亡可降低滋养层细胞中的病毒滴度，支持其在感染期间潜在的抗病毒作用。总之，这些发现揭示了胎盘限制SARS-CoV-2水平的一种可能机制。然而，这种反应伴随着胎盘铁隔离，可能损害母胎铁转移，凸显了铁与铁死亡介导的保护与损伤之间的微妙平衡。
**论文解读：SARS-CoV-2感染与胎盘铁死亡信号激活——抗病毒防御与铁稳态失衡的双重角色**
**一、研究背景与科学问题**
自2019年出现以来，SARS-CoV-2已导致全球超过700万人死亡。孕妇相较于非妊娠人群，面临着更高的COVID-19疾病严重程度和发病率风险，且SARS-CoV-2感染还会增加不良妊娠结局的发生概率，包括早产、死产和子痫前期等。纵向研究进一步揭示了妊娠期SARS-CoV-2感染对后代神经发育的长期影响。尽管疫苗接种显著降低了普通人群的传播率和死亡率，但孕妇群体的疫苗接种率低于非妊娠人群，使其面临更高的严重感染和不良结局风险。然而，感染介导不良妊娠结局的潜在机制尚未被充分阐明。
胎盘表达SARS-CoV-2进入受体血管紧张素转换酶2（ACE2），因此易受SARS-CoV-2感染。然而，经胎盘传播至胎儿的案例较为罕见，可能由于存在未明确的机制限制SARS-CoV-2在胎盘细胞中的复制。尽管病毒复制和垂直传播有限，SARS-CoV-2仍可引起胎盘功能和病理学的多种变化，包括SARS-CoV-2胎盘炎（慢性组织细胞性绒毛间隙炎、绒毛周围纤维蛋白沉积和滋养层坏死）、DNA损伤、合体结节形成增加、肾素-血管紧张素信号失调以及自噬流受损。多项研究还描述了SARS-CoV-2感染个体胎盘中氧化应激的增加，提示SARS-CoV-2感染可能触发氧化应激诱导的细胞死亡，如铁死亡——一种铁依赖性的细胞死亡形式，其特征为氧化还原反应降低和脂质过氧化增加。新兴证据支持铁死亡在各种妊娠并发症中的作用，尤其是子痫前期。因此，感染介导的胎盘铁死亡激活可能是COVID-19导致不良妊娠结局的机制之一。SARS-CoV-2已被证明在心脏、肺和血浆中激活或增加铁死亡的易感性。铁稳态失调，特别是高铁蛋白血症，也是COVID-19患者的常见发现。此外，铁死亡和铁失调与长新冠的发生和预后有关。然而，SARS-CoV-2是否同样影响胎盘的铁稳态和铁死亡，以及此类变化对宿主防御机制或不良妊娠结局的潜在影响，仍不清楚。
鉴于滋养层类器官能够在3D构型中重现多种滋养层亚型，它们是研究胎盘的有力体外模型。然而，传统滋养层类器官模型表现出反向极性，具有由细胞滋养层（CTBs）外层包围的合体滋养层（STBs）内核，称为STBIN。这种滋养层方向的反转给模拟定向过程（如胎盘营养转运和病原体垂直传播）带来了挑战。已有研究发现STBIN类器官对SARS-CoV-2感染的易感性非常有限，这可能是因为ACE2在STB层中表达更高，因此在STBIN构型中病毒无法接触ACE2。最近，多个研究小组报道了生成具有外STB层包围内CTB核的滋养层类器官模型的方法，称为STBOUT。除了更接近体内胎盘滋养层方向外，STBOUT类器官的STBs在激素转录本和各种营养转运过程的基因表达方面均有所增强，提示更接近体内STB功能。此外，将STB层暴露于培养环境应能更接近地模拟母血中病原体的垂直传播易感性。然而，现有的STBOUT生成方法需要额外考虑因素，如培养 agitation、接种胶原包被微珠或在定制的培养板中生长，增加了额外的技术障碍。
**二、研究目的与结论概述**
本研究旨在全面评估SARS-CoV-2感染引起的胎盘铁死亡及其机制。研究人员利用妊娠期感染个体的胎盘组织样本，结合体外滋养层细胞感染模型和3D干细胞来源滋养层类器官模型，系统研究了SARS-CoV-2感染对胎盘铁稳态和铁死亡信号通路的影响。研究结果表明，SARS-CoV-2暴露与胎盘铁积累、铁转运和储存蛋白定位改变以及铁死亡抑制剂GPX4表达降低相关。活性SARS-CoV-2感染损害了滋养层铁外排并激活铁死亡信号传导。药理学激活铁死亡信号可降低滋养层中的病毒滴度，提示铁死亡激活可能是限制胎盘病毒复制的保护机制。这些发现将铁死亡确定为胎盘对SARS-CoV-2感染的一种先前未被识别的反应，同时表明该通路的持续激活可能损害胎盘功能并导致COVID-19相关的不良妊娠结局。
**三、关键技术与方法**
研究人员使用了以下主要技术方法：1）人胎盘组织和脐带血样本来自圣路易斯华盛顿大学COVID-19妊娠安全性、检测/传播和结局（STOP-COVID-19）研究队列（IRB批准号202012075），样本于2021年12月至2022年7月期间从密苏里州圣路易斯的Barnes-Jewish医院分娩的已同意患者中收集，所有纳入个体均未接种SARS-CoV-2疫苗，排除标准包括妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病和早产；2）利用人绒毛膜癌细胞系JEG-3和CT30人滋养层干细胞（hTSC）系进行体外感染实验，在BSL-3及增强BSL-2条件下使用SARS-CoV-2 Delta变异株（B.1.617.2）以MOI 1（JEG-3细胞）和MOI 10（类器官）进行感染；3）开发了一种新的STBOUT类器官生成方法——将hTSCs接种于Matrigel中培养3天后，通过移液器吹打从Matrigel中释放，重悬于完全培养基后接种至Accutase预处理的AggreWell 400板中静态悬浮培养，于第6天进行感染实验，该方法无需胶原包被微珠或连续 agitation；4）采用普鲁士蓝染色检测胎盘组织中的铁沉积；5）通过Luminex技术定量脐带血中铁蛋白水平；6）采用比色法试剂盒定量胎盘组织中的总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平以及丙二醛（MDA）水平（TBARS法）；7）通过蛋白质印迹法检测铁转运和储存蛋白（TFRC、FPN、FTH、FTL）、铁调节蛋白（IRP1、IRP2）、铁死亡标志物（4HNE、ACSL4）和铁死亡抑制剂（GPX4、PLA2G6、FSP1）的表达；8）通过乳酸脱氢酶（LDH）释放实验测量细胞毒性；9）通过Vero细胞标准蚀斑实验测定病毒滴度；10）通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜评估蛋白定位和组织学特征。
**四、主要研究结果**
**患者人口统计学特征**：研究人员分析了SARS-CoV-2阴性（n = 10）和阳性（n = 10）两组孕妇的临床数据。为避免混杂效应，排除了患有妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病或早产的患者。SARS-CoV-2阳性组中80%在孕早期或孕中期感染，主要发生在Omicron变异株流行期（n = 8），其次为Delta变异株流行期（n = 2）。母体年龄、种族、合并症和围产期结局在两组间无显著差异。
**SARS-CoV-2暴露胎盘的持续病毒蛋白表达和铁积累**：在SARS-CoV-2阳性队列的胎盘组织中观察到含有SARS-CoV-2刺突蛋白的绒毛斑块，刺突蛋白表达仅限于合体滋养层。重要的是，收集时无需活动性感染即可检测到刺突蛋白——图中展示的是一位孕早期感染患者在足月分娩时胎盘仍显示刺突蛋白染色。普鲁士蓝染色显示，SARS-CoV-2阳性胎盘表现出强染色，表明铁积累，铁沉积位于绒毛斑块中并常定位于STB基底外侧膜。与胎盘铁积累一致，SARS-CoV-2阳性妊娠的脐带血铁蛋白水平呈下降趋势，提示铁向胎儿的转移不足。
**铁转运和储存蛋白定位改变**：SARS-CoV-2暴露不影响TFRC的定位和表达。FTH在未暴露胎盘中弥漫分布于基质，而在SARS-CoV-2阳性胎盘的特定基质细胞中呈强表达，但FTH强度的定量差异不显著。FPN的定位发生了显著改变：未暴露胎盘中FPN典型定位于STB基底膜以将铁外排至胎儿循环，而SARS-CoV-2阳性胎盘在基底膜和面向母体的微绒毛膜上均有FPN表达，MVM/BM比值显著升高，可能反映将过量铁回输至母体循环的尝试。
**胎盘铁死亡抑制剂GPX4表达降低**：与铁死亡易感性增加一致，SARS-CoV-2阳性胎盘中GPX4表达显著降低。但总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽水平无显著变化，两个脂质过氧化标志物——TBARS法测定的MDA水平和蛋白质印迹法测定的4HNE水平均无显著变化，ACSL4表达呈下降趋势。这表明虽然SARS-CoV-2暴露胎盘显示出一些与铁死亡信号一致的迹象，但在活动性感染停止后，活跃的脂质过氧化和铁死亡可能不会持续。
**SARS-CoV-2 Delta变异株破坏滋养层细胞铁转运并激活铁死亡**：感染JEG-3细胞后，FPN表达在48小时感染后显著降低，而TFRC、FTH和FTL无显著变化。铁反应元件结合蛋白2（IRP2）表达增加约10倍，IRP活性增加会抑制编码FPN的SLC40A1基因的翻译，导致铁外排减少。铁负荷处理（FAC）在接种前或接种后对病毒滴度均无显著影响。在铁死亡标志物方面，感染细胞中4HNE从24 hpi开始显著增加，至48 hpi达10倍增加；GPX4在48 hpi显著降低，同时NRF2蛋白水平也显著降低；GPX4在24 hpi显著增加，PLA2G6在早期时间点呈增加趋势后随感染进程逐渐减弱；FSP1在48 hpi显著增加。SARS-CoV-2感染细胞在72小时内未表现出LDH释放增加。使用FSP1抑制剂iFSP1或铁死亡激活剂RSL3在病毒感染后处理可显著降低病毒滴度，而接种前预处理无影响，表明铁死亡信号限制病毒复制和/或释放，而非影响病毒吸附或进入。
**STBOUT极性类器官的生成与特征**：研究人员开发了一种悬浮培养方法——hTSCs在Matrigel中培养3天后转移至AggreWell 400板中悬浮培养，可生成具有外STB层包围内CTB核的STBOUT类器官。STBOUT极性最早在转移至悬浮培养后24小时开始出现，至第6天超过90%的类器官具有一定程度的外STB覆盖。STBOUT类器官在外部STB层表达ACE2、TFRC和FPN。
**STBOUT滋养层类器官中SARS-CoV-2 Delta变异株损害铁外排并激活铁死亡**：STBOUT类器官对SARS-CoV-2 Delta变异株感染敏感，病毒蛋白表达几乎仅限于STB层。感染类器官在24和48 hpi表现出显著增加的LDH释放。与JEG-3细胞类似，FPN表达在72 hpi显著降低，TFRC、FTH、FTL无显著改变，IRP1/IRP2无显著变化。4HNE水平增加（因高变异性未达显著），ACSL4无显著变化，GPX4无变化，PLA2G6显著降低，FSP1显著增加。iFSP1处理使STBOUT类器官中的病毒滴率降低超过50%，但由于高变异性未达统计显著。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，SARS-CoV-2感染后胎盘中的铁死亡激活可能发挥双重功能：一方面通过限制病毒复制发挥保护作用，另一方面导致铁稳态紊乱和胎盘损伤。这种效应具有组织特异性——在非胎盘组织中铁死亡促进SARS-CoV-2复制，而在胎盘中铁死亡限制病毒传播，提示妊娠期全身性调节铁死亡可能产生意想不到的后果。铁死亡信号在低病毒滴度下即可引起广泛的铁处理和铁死亡标志物变化，表明存在显著的旁观者效应，可能通过质膜接触、隧道纳米管和细胞外囊泡等方式在邻近细胞间传播。
研究人员总结道，铁死亡是胎盘对SARS-CoV-2感染的一种双重功能反应，可能以改变铁处理和胎盘稳态为代价来限制病毒复制。感染诱导的铁失调持续至病毒清除之后，可能导致不良妊娠结局，凸显了胎盘作为抗病毒防御与发育需求交汇位点的独特性。这些发现强调了在妊娠期独特的免疫代谢背景下研究宿主-病原体相互作用的重要性。
