A859L在非洲猪瘟病毒高效复制中的关键作用及作为抗病毒药物靶标的研究

《Viruses》：A859L Plays a Critical Role in Facilitating Efficient African Swine Fever Virus Replication

　　

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一种高致病性病原体，对全球养猪业构成严重威胁。ASFV编码的RNA解旋酶A859L的生物学功能在很大程度上仍然未知。在本研究中，研究人员证明A859L在不同ASFV分离株中高度保守，属于RNA解旋酶SF2超家族，具有典型的Walker A（GKT）和Walker B（DECH）基序。感染后多个时间点的转录组学分析进一步揭示A859L是一个晚期表达基因。功能实验表明，siRNA介导的A859L敲低在易感的巨噬细胞（PAMs和BMDMs）及WSL细胞中均显著抑制子代病毒的产生。这种敲低还显著降低了病毒蛋白p30和p72的表达，以及其他病毒解旋酶基因（QP509L、Q706L、D1133L和B962L）的胞内mRNA水平，凸显了A859L在病毒生命周期中的重要作用。相反，A859L过表达则增强病毒增殖。值得注意的是，对病毒解旋酶活性的药理抑制有效抑制了ASFV复制。综上所述，研究数据确立A859L为ASFV复制的关键决定因素和抗病毒药物研发的有前景候选靶点。

**1. 研究背景与问题提出**

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的严重危害全球养猪业的急性出血性传染病，家猪死亡率可达100%。该病于1921年在肯尼亚首次分离到病原，此后传播至全球多个国家和地区，世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须通报动物疫病。自2018年8月在中国出现以来，ASF每年造成数十亿美元的经济损失，并被中国列为第一类动物传染病。ASFV是一种大型双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）病毒，属于非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfarvirus），基因组长度为170-194 kb，包含151-167个开放阅读框（open reading frames，ORFs），编码至少160种蛋白质，其中大部分功能尚未表征。目前尚无安全有效的疫苗或批准的抗病毒药物，防控形势极为严峻。

病毒RNA解旋酶是参与病毒基因组复制、转录和翻译等生命周期关键过程的马达蛋白，可解开双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）或解离RNA-蛋白质复合体。多数此类酶属于解旋酶超家族1（helicase superfamily 1，SF1）或超家族2（helicase superfamily 2，SF2），两者共享保守的催化核心结构域。位于不同病毒中高度保守且缺乏宿主同源物，病毒RNA解旋酶构成广谱抗病毒药物研发的有前景靶点。ASFV共编码5个推定RNA解旋酶：D1133L、B962L、QP509L、Q706L和A859L。既往研究显示SF2解旋酶QP509L和Q706L在病毒工厂共定位且对病毒增殖必需的，而一个敲除A859L基因的重组ASFV在猪巨噬细胞培养物和家猪体内复制效率与亲本毒株相当，表明A859L在标准条件下遗传上并非必需，对其在病毒生命周期中的实际贡献提出了重要科学问题。为进一步探究这一空白科学问题，研究人员研究了对A859L的生物学功能进行了系统表征。

**2. 研究结果与主要发现**

**2.1 A859L在不同ASFV分离株中高度保守**

研究人员从NCBI Virus数据库中检索了25个代表性ASFV分离株的全长A859L氨基酸序列，覆盖基因I型（如BA71V）和基因II型（如Georgia_2008/1及包括Pig/HLJ/2018在内的欧亚田间毒株）及多个非洲分离株，地域横跨亚洲、欧洲和非洲。在使用组成型调整替换矩阵进行多重序列比对后发现，A859L蛋白在整个蛋白区域的氨基酸序列一致性约为99%，替换仅局限于有限位点（如第312、145、381、382、421、426、751、355等位点），且主要存在于少数毒株中（如BA71V和Pig/Henan/123014/2022），大多数分离株与参考序列完全一致。

**2.2 A859L解旋酶活性位点的结构特征**

研究人员利用AlphaFold 3（AF3）在线预测平台提交A859L氨基酸序列并生成三维结构模型，使用PyMOL软件可视化后发现A859L核心结构域呈现典型的RNA解旋酶活性口袋构象。通过InterProScan比对进一步分析验证，A859L具有SF2超家族解旋酶的特征性保守基序，即Walker A（¹⁹⁵GKT¹⁹⁷）和Walker B（²⁹⁷DECH³⁰⁰），两者均定位于核心催化口袋内，在空间上高度邻近，共同构成功能性解旋酶活性口袋。

**2.3 A859L的转录动力学与亚细胞定位**

研究人员将猪肺泡巨噬细胞（PAMs）感染ASFV并在0、3、6、9、12、18、24、36和48小时收取细胞样品，利用RT-qPCR检测mRNA水平。研究发现早期基因标志物CP204L（编码p30蛋白）的mRNA水平在感毒后3小时迅速上升，而A859L转录本在9小时才开始明显上调，至9小时前检测不到，符合晚期表达基因特征。在猪骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中观察到相似表达趋势。亚细胞定位方面，研究人员通过免疫荧光实验（IFA）证实A859L主要分布于细胞质。

**2.4 A859L对ASFV复制至关重要**

研究人员设计特异性siRNA转染PAMs，通过RT-qPCR确认敲低效率后，发现p30蛋白和p72蛋白表达水平显著降低，同时细胞内其他病毒解旋酶基因（QP509L、Q706L、D1133L和B962L）的mRNA水平也同步降低。血红吸附实验（Hemadsorption assay）表明胞外感染性病毒粒子产量受到显著抑制。BMDMs中的实验同样验证了A859L的敲低效果，即同步减少病毒基因表达和传染性病毒产生。

**2.5 A859L促进ASFV复制**

研究人员在野猪肺细胞系WSL中的后续实验进一步验证：siRNA介导的A859L敲降低降低了WSL细胞中病毒基因（CP204L、B646L及其他解旋酶基因）mRNA水平、病毒蛋白（p72、p30）表达量以及细胞外子代病毒产生量，进一步验证了A859L在不同细胞类型中的重要作用。相反，过表达A859L能够以剂量依赖性的方式增加病毒蛋白和病毒基因的表达水平，并显著提高细胞外病毒感染性病毒产量。敲低-回补（knockdown-rescue）实验，即通过siRNA敲低内源性A859L后转染siRNA耐药的Strep标记A859L表达质粒，结果显示pRK-srA859L-Strep的恢复表达可部分回补病毒蛋白表达和感染性病毒产量，证实A859L对ASFV复制的促进作用具有特异性。

**2.6 解旋酶活性对ASFV复制至关重要**

研究人员采用己定已知的HSV-1 UL5解旋酶抑制剂Pritelivir处理A859L，用于阻断A859L的酶活性。Western blot分析显示Pritelivir以浓度依赖性方式降低PAMs和BMDMs中p30、p72蛋白的表达水平。RT-qPCR结果表明相关病毒解旋酶基因mRNA水平显著下降，HAD50蓝效价显示细胞外感染性病毒粒子显著减少。CCK-8细胞存活率实验血清药浓度可用条件下未观察到明显细胞毒性。此外，在感染后早期时间点（9 hpi）检查发现Pritelivir处理不影响病毒解旋酶基因的转录水平，表明其抑制效应是直接靶向已有的解旋酶蛋白活性而非转录调控。

**3. 技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：多重序列比对（使用Jalview软件和ClustalW算法）；AlphaFold 3蛋白结构预测和PyMOL可视化分析；RT-qPCR基因表达定量分析；Western blot蛋白表达检测；siRNA介导的基因敲低、过表达和敲低-回补实验；血红吸附试验（hemadsorption assay）测定病毒滴度；CCRCK-8细胞活力检测与免疫荧光（IFA）结合共聚焦显微镜技术。样本来源包括原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）、猪骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）、自然猪肾脏上皮细胞系PK-15和野猪肺细胞系WSL，ASFV CN/GS/2018毒株由兰州兽医研究所中国农业科学院提供。所有ASFV相关实验均在BSL-3实验室开展。

**4. 讨论与结论**

研究发现A859L在ASFV各基因型和地理来源的分离株中显示出99%以上的氨基酸一致性，表明其受到强纯化选择压力，为发挥病毒生命周期关键功能所保存。如此高水平的保守性通常表现为病毒生存和增殖所必需的功能蛋白，由于耐药突变发展空间受限而使其成为具有吸引力的抗病毒干预靶点。这一与传统基因敲除实验表型差异并不矛盾：基因敲除需经多轮同源重组及筛选，期间可能产生补偿性突变或适应性变化以抵消A859L缺失的影响；而siRNA介导的敲低及Pritelivir快速阻断其酶活功能，在短时间内阻止了可能发生的补偿性进化，从而揭示了更直接的必需性表明。相比之下，此种速度较快的急性功能性阻断更能在补偿机制激活前触发复制停滞，从而暴露了在适应型缺失突变体中可能被掩盖的必需功能。此外，A859L的表达谱与病毒复制过程中的转录要求相符合，其功能的缺失会对病毒RNA代谢全局产生严重影响，支持其作为ASFV复制-转录复合体中广泛的RNA代谢促进因子的模型假说。天然胰病毒RNA解旋酶在调控病毒基因组表达和协调复制中发挥核心功能，如寨卡病毒（ZIKV）非结构蛋白3（NS3）的DExH解旋酶结构域缺失抑制即可对病毒复制产生严重干扰，进而验证了以A859L为靶点的有效性策略的一致性。Pritelivir通过靶向ASFV的保守解旋酶结构以浓度依赖性方式抑制了其酶活性，在有效抑制病毒复制的浓度下并不损害宿主细胞活力，为针对A859L的抗ASFV新药研发提供了实验基础。这一工作为阐明ASFV的新型致病机制和制定以A859L为核心靶点的抗ASF策略提供了坚实的理论基础。

研究结论显示，研究人员的研究结果确定A859L为ASFV复制的关键因子。具体而言，siRNA介导的A859L敲低显著降低了细胞内病毒mRNA和蛋白水平（包括其他ASFV RNA解旋酶的表达），减少了细胞外传染性病毒粒子的产生，这对病毒繁殖至关重要。相反，A859L的过表达增强了病毒复制。此外，鉴于A859L作为RNA解旋酶的功能，利用Pritelivir对其解旋酶活性的药理抑制有效地抑制了病毒增殖。综上所述，这些数据确立了A859L作为ASFV复制的关键决定性因子，并确立其为抗病毒药物研发的有前景靶点候选。