乌克兰迁徙鸟类低致病性A型禽流感病毒的分子监测及部分遗传特征

《Viruses》：Molecular Surveillance and Partial Genetic Characterization of Low-Pathogenic Avian Influenza A Viruses in Migrating Birds from Ukraine

　　

野生迁徙鸟类是A型流感病毒（IAVs）的主要自然储存宿主，并在其进化和全球传播中发挥核心作用。乌克兰地处黑海—地中海迁徙路线上，因此在“同一健康”（One Health）框架下，对野生鸟类中禽流感病毒进行监测至关重要，尽管该地区的基因组数据仍然有限。2025年10月至2026年1月期间，研究人员在“图兹利夫斯基利马尼”国家自然公园及周边地区，从迁徙鸟类和混合物种群中采集了604份泄殖腔拭子、口咽拭子及环境粪便样本，并同时采集了附近家禽的样本。采用靶向基质基因的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测A型流感病毒，随后进行H₅/H₇亚型筛查、完整血凝素基因的Oxford Nanopore测序及系统发育分析。结果显示，在604份样本中有30份（4.97%）检出A型流感病毒RNA，而所有样本的H₅和H₇亚型均为阴性。完整血凝素序列揭示了三种低致病性亚型（H₁、H₄和H₆），它们归属于已建立的欧亚谱系，与欧洲、亚洲和北美洲流行的当代禽流感病毒密切相关。在家禽样本中未检出A型流感病毒或新城疫病毒。这些发现为乌克兰禽流感监测提供了重要的基因组基线，并展示了便携式纳米孔测序与一体化“同一健康”监测在监测病毒多样性和支持新发流感威胁早期发现方面的价值。

禽流感病毒（AIV）是影响动物健康、野生动物保护和全球公共卫生的重要新发病原体。A型流感病毒属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），其自然储存宿主主要为雁形目和鸻形目野生水鸟。这些鸟类通过大规模迁徙维持病毒多样性并促进洲际传播。乌克兰位于黑海—地中海迁徙路线的关键地带，是数百万只迁徙鸟类的停歇地和越冬地，其南部湿地生态系统为野生水鸟、留鸟和家禽提供了复杂的生态接触界面。然而，该区域此前关于野生鸟类中低致病性禽流感病毒的基因组数据十分有限，既有监测主要集中于高致病性H5亚型暴发事件的靶向检测，缺乏对自然储存宿主中低致病性毒株的系统性分子刻画。为了填补这一空白，本研究在“同一健康（One Health）”框架下，于2025年10月至2026年1月对乌克兰南部图兹利夫斯基利马尼国家自然公园及其周边地区的野生和家养鸟类开展了A型流感病毒监测，旨在建立该区域的分子基线，评估病毒在野生鸟类中的循环情况及其向家禽传播的潜在风险。

研究人员共采集了604份野生鸟类泄殖腔拭子、口咽拭子和环境粪便样本，并采集了邻近散养家禽的拭子与粪便样本。通过实时RT-PCR筛查A型流感病毒基质基因，随后对阳性样本进行H₅/H₇筛查，并采用基于Oxford Nanopore的扩增子测序获得完整血凝素（HA）基因序列，最后通过最大似然法构建系统发育树进行遗传背景分析。结果显示，30份野生鸟类样本（4.97%）检出A型流感病毒RNA，全部阴性H₅/H₇；共鉴定出三种低致病性血凝素亚型（H₁、H₄和H₆），其序列分别与欧亚及北美谱系中的当代毒株聚集成簇。家禽样本中未检出A型流感病毒和纽卡斯尔病病毒。该研究首次为乌克兰提供了基于完整HA基因的低致病性禽流感病毒分子特征基线，证实了便携式纳米孔测序在野外监测中的适用性，并强调一体化监测对预警新发流感威胁的价值。

关键的技术方法包括：在样本来源上，研究队列覆盖了乌克兰图兹利夫斯基利马尼国家自然公园及周边地区，包括野生鸟类个体样本（如绿头鸭、白额雁、黑腹滨鹬等）、混合物种群粪便样本以及附近家禽样本，共604份加对应家禽样本。方法上，研究人员采用基于基质基因的实时RT-PCR进行初筛，利用通用引物进行多片段RT-PCR扩增全长HA基因片段（约1.7 kb），随后通过Oxford Nanopore MinION平台进行纳米孔测序，并使用生物信息学工具进行序列比对和一致性序列生成；系统发育分析采用MAFFT比对和MEGA12中的最大似然法（1000次Bootstrap支持）。上述方法无需病毒分离即可获取关键遗传信息，适合资源有限的监测场景。

在结果部分，“流感A病毒检测与亚型确定”：通过实时RT-PCR筛查全部样本，确认604份野生鸟类相关样本中30份A型流感病毒RNA阳性，总阳性率为4.97%；所有阳性样本均非H₅或H₇亚型，表明当地循环的是低致病性病毒。在个体鉴定中，绿头鸭（Anas platyrhynchos）阳性率最高（11.1%），其次为白额雁（Anser albifrons）5.0%和黑腹滨鹬（Calidris alpina）4.1%；混合物种群粪便阳性率为3.0%。“HA基因扩增与纳米孔测序”：研究人员成功从代表性阳性样本中扩增出全长HA基因并完成测序，平均覆盖度超过100×，能够准确获得一致性序列。“流感A病毒亚型鉴定”：通过参考序列映射并经FluSurver和NCBI工具验证，确认所有测序样本属于H₁、H₄和H₆三种亚型，序列已提交GenBank。“系统发育分析”：最大似然树显示，三个乌克兰H₁分离株与德国、比利时（2017年）和加拿大（2010年）的H₁病毒形成紧密的单系簇，并与欧洲猪源H₁病毒相近；两个H₄分离株与欧亚野生鸟类中的H₄病毒同处于一个末梢分支，与亚洲和欧洲的既往分离株高度相似；一个H₆分离株则与越南和中国的H₆病毒聚集成群，提示其可能是经自然迁徙近期引入，而非长期独立进化。

讨论部分总结如下：本研究表明低致病性禽流感病毒正在乌克兰黑海沿岸湿地野生动物中活跃循环，且在与野生鸟类密切接触的散养家禽中未检测到溢出事件。约5%的总阳性率与欧洲和亚洲的监测数据（2%–10%）一致。H₁、H₄和H₆亚型是欧亚野生水鸟中常见的低致病性亚型，其系统发育位置支持迁徙鸟类通过重叠迁徙路线实现病毒基因的洲际交流。牛津纳米孔测序在本研究中显示了较好的可操作性和可靠性。研究也存在局限，包括仅覆盖单个迁徙季节、仅测序HA基因而无法分析其他片段的重配动态，以及未对所有阳性样本进行病毒分离。未来需开展多年度、全基因组监测并整合生态学数据。

研究结论翻译如下：本研究成功应用了实时RT-PCR、Oxford Nanopore测序和系统发育分析相结合的综合分子监测方法，调查了乌克兰黑海沿海湿地迁徙鸟类中禽流感病毒的循环情况，扩展了东欧A型流感病毒生态学知识，并提供了宝贵的基线基因组数据。主要结论包括：（1）确证低致病性禽流感病毒在该国家自然公园野生迁徙鸟类中活跃循环，总阳性率为4.97%（30/604），监测期内未检出高致病性H₅或H₇病毒；（2）野生水鸟和涉禽是乌克兰A型流感病毒的主要自然储存宿主，其中绿头鸭、白额雁和黑腹滨鹬检出率最高；（3）Oxford Nanopore测序是快速基因组监测的有效工具，成功生成了完整HA基因序列并支持亚型鉴定和系统发育分析；（4）共鉴定出H₁、H₄和H₆三种血凝素亚型，均为与迁徙水鸟密切相关的低致病性病毒，序列已提交GenBank；（5）系统发育分析显示乌克兰分离株属于已确立的欧亚禽流感病毒谱系，与近期欧洲和亚洲的鸟类来源毒株关系密切，支持迁徙鸟类通过重叠迁徙路线促进A型流感病毒持续洲际交流的假说。该研究为乌克兰建立了重要的分子基线，未来可用于监测病毒进化、检测新变异株和高致病性禽流感的早期预警。