甲型流感病毒RNA聚合酶富集于天然免疫应答基因的染色质上

《Viruses》：Influenza A Virus RNA Polymerase Is Enriched on the Chromatin of Innate Immune Response Genes

　　

摘要专业翻译 甲型流感病毒通过从细胞RNA上“抢夺”分子帽来启动自身转录，从而劫持宿主细胞机制。虽然这一过程通常与基因起始区域相关，但本研究揭示，病毒RNA聚合酶对宿主基因表达产生了深远影响。通过全基因组定位和比较通路分析，研究人员发现，病毒聚合酶（FluPol）的募集与一般宿主转录活性解耦；相反，FluPol显著富集于与防御相关通路相关的特定启动子和增强子亚群。在起始位点之外，FluPol在整个延伸过程中仍与宿主转录本结合，并延伸至基因下游（DoG）区域。它进一步积聚在基因末端，可能导致广泛的转录终止缺陷。通过与整个基因体上的宿主转录本保持连接，FluPol可能延长其进行帽抢夺的机会，并损害细胞转录机制的循环利用。总之，这些发现表明，FluPol在关键细胞防御位点的积累跨越了从起始到终止的全过程，从而驱动宿主转录衰减。

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研究背景与科学问题

甲型流感病毒（IAV）是一种RNA病毒，其复制依赖于宿主细胞核内的RNA聚合酶II（RNAPII）。病毒转录依赖其自身的RNA聚合酶复合物（FluPol），该复合物由PA、PB1和PB2三个亚基组成。FluPol通过一种称为“帽抢夺”的过程启动病毒转录：其PA亚基的内切核酸酶活性切割宿主加帽转录本的5‘端，产生短RNA引物，随后用于合成病毒mRNA。传统观点认为，帽抢夺主要发生在转录早期、靠近启动子的区域，即RNAPII暂停等待有效延伸的位置。然而，已有观察提示，这种“非特异性、仅限于启动子”的模型可能无法完全反映病毒与宿主转录机器相互作用的复杂性。例如，有限的测序深度和短引物定位困难可能引入偏差；此外，磷酸化的Ser5-RNAPII（S5p）并非仅存在于启动子区，加帽酶也出现在基因内部和终止位点。更重要的是，帽抢夺不仅限于收获帽引物，其对新生转录本的切割还会触发由整合子复合物介导的早期转录衰减，导致RNAPII进入有效延伸的通量大幅降低。同时，IAV还通过NS1蛋白抑制转录终止复合物，造成全局性的终止缺陷，使RNAPII发生通读转录，产生基因下游转录本（DoG RNA）。这些现象提示，帽抢夺引发的5‘端早期衰减和NS1驱动的3’端通读可能是病毒瘫痪宿主转录的统一策略的两个方面。因此，研究人员有必要重新审视宿主与病毒转录机器之间的相互作用，以阐明FluPol在染色质上的动态分布及其对宿主防御基因的特异性抑制机制。

研究方法概述

为了全面探究IAV感染对宿主转录的影响，研究人员采用了多种高通量技术。首先，对感染H1N1病毒（A/WSN/33株）的人肺上皮A549细胞进行染色质结合RNA测序（chrRNA-seq），以捕获新生转录本的动态变化。其次，利用针对FluPol各亚基（PA、PB1、PB2）的特异性抗体进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），绘制FluPol在全基因组范围内的结合图谱。为克服天然抗体在RNA-ChIP中的局限性，研究人员还构建了携带V5标签的PA亚基的重组病毒，并进行了V5-PA RNA-ChIP-seq实验，以鉴定与FluPol结合的染色质RNA种类。所有测序数据均经过严格的生物信息学分析，包括差异表达分析和通路富集分析。

主要研究结果

3.1 染色质关联RNA的高通量测序揭示IAV感染诱导广泛的转录扰动

通过对感染6小时后的A549细胞进行chrRNA-seq，研究人员发现高达40%的高表达基因发生了差异调控。感染导致显著的转录终止缺陷，几乎所有依赖经典多聚腺苷酸化复合物的基因都产生了DoG转录本，而复制依赖性组蛋白基因则不产生DoG。RNAPII的ChIP实验证实，感染后RNAPII在启动子和基因体区域的积累减少，而在基因间区和未表达基因位点则增加，表明转录终止缺陷导致了RNAPII的重新分布。

3.2 染色质结合RNA的定量分析确认IAV感染诱导转录终止缺陷

通过对TTS下游40kb区域进行定量分析，研究人员发现超过一半的下游区域转录水平上调至少1.5倍，而仅有不到1.5%的区域下调。约38%的上调DoG来自上调表达的基因，但仍有半数来自不受感染影响的基因，这强烈支持IAV对终止过程的直接影响。值得注意的是，部分沉默基因产生的DoG信号实际上是来自邻近基因的通读转录。

3.3 全基因组分析揭示FluPol富集于转录活跃的染色质以抑制宿主抗病毒反应

ChIP-seq分析显示，FluPol亚基在感染细胞中特异性富集于活跃基因的启动子区域，且这种富集与H3K27ac修饰水平正相关，但与基线表达水平的相关性极弱。重要的是，FluPol的募集并非被动地跟随高转录活性，而是优先靶向与感染和防御反应相关的基因通路。被FluPol占据的基因更倾向于在感染后下调表达，而那些H3K27ac水平升高的基因则表现出更高的FluPol占有率，表明FluPol可能特异性地抑制正在被激活的宿主防御基因。

3.4 FluPol被招募到免疫应答基因附近的增强子区域

研究人员进一步发现，FluPol同样富集于远离启动子的增强子区域，且其富集程度与增强子的活性（H3K27ac水平）正相关。功能分析表明，被FluPol占据的增强子所邻近的基因显著富集于先天防御和病毒感染信号通路，而未被FluPol占据的对照增强子则无此特征，提示FluPol可能通过作用于特定增强子来调节免疫应答。

3.5 FluPol与基因内部的染色质结合RNA相关联

利用V5-PA重组病毒进行的RNA-ChIP-seq实验证实，V5-PA广泛分布于大量表达基因的编码区，且其关联并不局限于最高表达的基因。有趣的是，V5-PA结合的RNA中，外显子序列（即剪接后的染色质RNA）的富集程度更高，且这部分RNA主要来源于感染后上调的基因。通路分析显示，V5-PA结合的RNA显著富集于干扰素（IFN）信号通路，如OAS、DDX58/60、ISG15/20等基因。

3.6 FluPol与源自基因终止位点和下游区域的染色质结合RNA相关联

定量分析显示，V5-PA在TTS下游的DoG区域也有显著富集，且在上调的DoG中，V5-PA的结合比例是未变化DoG的四倍。DNA ChIP-seq也证实PA和PB1亚基在表达基因的TTS和下游区域富集。对共同被两种方法（RNA-ChIP和DNA ChIP）鉴定的118个基因进行分析，发现它们高度富集于病毒感染相关通路，如EBV、CMV、HIV-1感染等。

结论与意义

本研究首次提供了FluPol在宿主基因组上的大规模足迹，揭示了其存在范围远超传统认知的启动子和增强子区域，贯穿基因体和转录终止位点直至下游基因间区。研究人员提出，FluPol与整个转录单位的持续关联可能为病毒提供双重优势：一方面优化从新生RNA上进行帽抢夺的效率，另一方面提供一个空间平台来干扰宿主终止因子。这种在防御相关位点的特异性积累，补充了NS1蛋白的已知抑制作用，有效抑制了宿主的转录应答。该发现扩展了FluPol在初级转录起始之外的功能够能谱，并为未来研究病毒适应蛋白或宿主驱动的染色质开放如何决定这种关联提供了框架。