哈萨克斯坦两处地热系统相关微生物群落的鸟枪法宏基因组学比较研究

《Biology》：Comparative Shotgun Metagenomics of Microbial Communities Associated with Two Geothermal Systems in Kazakhstan

　　

摘要专业翻译 与地热相关的微生物群落在中亚地区仍缺乏充分研究。本研究采用鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）对哈萨克斯坦琼扎（Chundzha）与拉赫曼（Rakhman）两处地热系统中受热影响的基质相关微生物群落进行比较分析。每个位点设置三个空间重复，共获得6个宏基因组，每份样本产生约6.5–7.3 Gb的清洁序列数据。物种水平丰富度呈现琼扎较高的方向性趋势，而两处位点的香农多样性（Shannon diversity）相近。基于属水平的布雷–柯蒂斯排序（Bray–Curtis ordination）显示出明显的位点相关分离，采样位点解释了87.3%的变异，但该效应未达到统计学显著水平（PERMANOVA，R2 = 0.873，p = 0.10）。琼扎在若干嗜盐及耐盐类群上表现出更高的相对占比，而拉赫曼则在土壤相关谱系上占比更高。两处位点的宽泛COG与KEGG功能谱大体相近。拉赫曼在若干氢化酶（hydrogenase）、固氮酶（nitrogenase）及RuBisCO相关基因上表现出更高的相对占比，而琼扎则在部分发酵及光合作用相关功能上相对更高；然而，经FDR校正后，所有靶向KO比较均未保持显著。上述结果表明，候选分类与功能模式因重复数有限而应视为探索性发现。该数据集为哈萨克斯坦地热相关微生物群落未来的基因组解析及宏转录组研究提供了基线资源。

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一、研究背景与问题提出

地热泉是天然异质性生态系统，温度、pH、矿物组成、氧化还原条件以及电子供体和受体的可利用性等环境因子对微生物群落发挥过滤作用。这些梯度即使在地理上相近的热液系统之间也能产生显著的群落组成差异，使地热生境成为研究环境条件、微生物多样性与代谢潜力之间联系的理想模型。已有大规模跨系统调查表明，各环境驱动因子的相对重要性具有情境依赖性：在新西兰925个地热泉中，约70°C以下时pH是微生物多样性的最强关联因子，而更高温度下温度的作用更为突出；加拿大和新西兰36个地热区的调查则报告了跨越广泛温度范围的强温度–多样性关系；青藏高原热泉研究显示温度强烈塑造群落组成，即使丰富度和香农多样性均与温度无显著相关。然而，与北美和亚洲研究较为深入的地热区域相比，中亚热液生态系统在鸟枪法宏基因组学研究中仍相对不足。哈萨克斯坦境内针对地理上分离的地热系统的比较性鸟枪法宏基因组学研究尤为稀缺。琼扎与拉赫曼地热系统因处于对比鲜明的地理与水文地质环境而构成有价值的比较对象：琼扎与伊犁盆地东南部低矿化地热水相关，而拉赫曼泉位于南阿尔泰山区，被描述为含硅、含氡的热水。此类对比性环境为检验受热影响基质群落是否在分类组成上存在差异同时保留重叠的基因组功能潜力提供了生态背景。

二、研究内容与主要结论

研究人员于2025年7月从哈萨克斯坦两处地理上分离的地热系统采集了与热水平直接接触的湿润土壤/基质样本，每个位点设置三个空间重复（间距约5 m），共6份样本。琼扎热泉水温约38–50°C、pH 7–8；拉赫曼热泉水温约30–40°C、pH约8。通过鸟枪法宏基因组测序，研究人员比较了两处地热系统相关微生物群落的分类组成与基因组功能潜力，并进一步评估了与氢代谢、固氮、RuBisCO相关碳固定、脂质代谢、发酵及光合作用相关的候选功能，为未来基因组解析和表达水平研究提供靶向目标。

研究得出以下主要结论：物种水平丰富度呈现琼扎较高的方向性趋势（琼扎均值27,417 ± 67，拉赫曼20,012.7 ± 466.2），但未达统计显著（p = 0.0809；q = 0.1078）；香农多样性两处相近（p = 0.6625）。属水平布雷–柯蒂斯排序显示明显的位点相关分离，PC1解释87.63%变异，但PERMANOVA（R2 = 0.873，p = 0.10）、ANOSIM（R = 1.000，p = 0.093）及PERMDISP（F = 5.278，p = 0.10）均未提供常规统计支持。分类组成方面，细菌在两处位点均占主导，但古菌在琼扎的合并占比（约9.4%）高于拉赫曼（约2.2%）；琼扎富含嗜盐的Methanobacteriota/Halobacteria相关谱系，拉赫曼则相对更富Candidatus Bathyarchaeota/Bathyarchaeia相关谱系。属水平上，琼扎相对富集Salegentibacter、Halomonas、Halalkalicoccus、Salinimicrobium、Kocuria、Nocardioides和Marinobacter等嗜盐/耐盐类群，拉赫曼则相对富集Bradyrhizobium、Sphingomonas、Pseudolabrys、Rugositalaea及Candidatus Udaeobacter等土壤相关谱系。功能层面，两处位点共享广泛的COG与KEGG功能谱；拉赫曼在若干氢化酶相关基因（hupL、hupS、hypA、hypB、hypD、hypF）、固氮酶相关基因（nifD、nifH、nifE、nifK、nifN）及RuBisCO相关基因（rbcL、rbcS）上平均相对占比更高，琼扎则在部分发酵相关基因（hbd、crt、bcd）和光合作用相关功能上相对更高；但经FDR校正后所有靶向KO比较均未保持显著。该研究的重要意义在于为哈萨克斯坦地热相关微生物群落提供了基线资源，识别出值得进一步开展基因组解析和表达水平研究的候选分类与功能模式。

三、关键技术与方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：样本采集方面，从琼扎和拉赫曼两处地热系统各采集3个空间重复的湿润基质样本（间距约5 m，直接接触热水的基质而非周围环境土壤）。DNA提取使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit，在Illumina NovaSeq平台进行双端150 bp鸟枪法宏基因组测序。生物信息学流程包括：fastp v0.23.0进行质量过滤；MEGAHIT v1.2.9独立组装；Prodigal v2.6.3预测开放阅读框；CD-HIT v4.6.1以≥90%序列一致性和≥90%覆盖度聚类生成非冗余基因目录；SOAPaligner v2.21以≥95%一致性进行读段回帖定量。功能注释方面，使用DIAMOND v2.0.13以BLASTP模式比对NCBI NR数据库进行分类注释，功能注释针对KEGG、COG和MetaCyc数据库。统计分析采用双尾Wilcoxon秩和检验、FDR校正（Benjamini–Hochberg）、PERMANOVA（Adonis）、ANOSIM、PERMDISP、LEfSe等。

四、研究结果

4.1 宏基因组数据集特征

6个文库每样本产生约43.49–48.70百万条原始读段（6.57–7.35 Gb），质量过滤后保留99.40–99.49%读段。每样本组装产生91,171–213,037条重叠群，总组装长度65.55–191.94 Mb，N50值680–855 bp。每样本预测120,516–322,892个开放阅读框。整个18样本测序项目共预测4,264,940个基因，聚类生成包含2,584,135个基因的非冗余目录（总长约1.49 Gb），其中92.67%获得NR注释、68.50%获得KEGG注释、77.76%获得COG注释。

4.2 琼扎与拉赫曼微生物群落的Alpha与Beta多样性

物种水平丰富度呈现琼扎较高的方向性趋势（均值27,417 ± 67 vs 20,012.7 ± 466.2），但未达统计显著（p = 0.0809；q = 0.1078）。各样本内Sobs、ACE和Chao1值相同，源于物种水平谱系中无单例物种。香农多样性两处相近（7.081 ± 0.139 vs 7.228 ± 0.265；p = 0.6625）。属水平PCoA显示PC1解释87.63%变异，琼扎重复形成紧凑聚类而拉赫曼沿PC2分布更分散；PERMANOVA（R2 = 0.873，p = 0.10）与ANOSIM（R = 1.000，p = 0.093）均未提供统计支持。PERMDISP未检测到组内离散度的显著差异（F = 5.278，p = 0.10）。

4.3 分类组成与群落结构

细菌在两处位点均占主导，但古菌在琼扎合并占比（约9.4%）高于拉赫曼（约2.2%）。琼扎古菌部分包含显著的Methanobacteriota/Halobacteria相关谱系（如Halalkalicoccus、Natrinema、Natronococcus），拉赫曼则相对更富Candidatus Bathyarchaeota/Bathyarchaeia相关谱系。属水平上，琼扎相对富集Salegentibacter、Halomonas、Halalkalicoccus、Salinimicrobium、Kocuria、Nocardioides和Marinobacter；拉赫曼相对富集Bradyrhizobium、Sphingomonas、Pseudolabrys、Rugositalaea和Candidatus Udaeobacter。两处群落共享许多细菌和古菌谱系，但在相对贡献上存在差异。

4.4 琼扎与拉赫曼之间的差异分类特征

探索性LEfSe分析显示，琼扎相关的最强属级特征包括Nocardioides（LDA = 4.166）、Salegentibacter（LDA = 4.510）、Salinimicrobium（LDA = 4.457）和Halomonas（LDA = 4.433）；拉赫曼相关特征包括Bradyrhizobium（LDA = 4.832）和Candidatus Udaeobacter（LDA = 4.483）。因未在LEfSe特征集内进行多重检验校正且每处仅3个重复，这些类群应视为探索性判别特征而非验证性生物标志物。

4.5 琼扎与拉赫曼宏基因组的功能谱

两处群落均包含参与核心细胞过程和代谢的广泛基因。最丰富的COG类别包括氨基酸转运与代谢、一般功能预测、能量产生与转化、碳水化合物转运与代谢、脂质转运与代谢、翻译与核糖体生物发生、细胞壁/膜/包膜生物发生、信号转导及无机离子转运与代谢。KEGG通路水平2上，琼扎在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅因子与维生素代谢、脂质代谢及全局概览图方面相对更高；拉赫曼在能量代谢、信号转导、原核细胞群落及膜转运方面相对更高。水平3上，琼扎在代谢通路、次级代谢产物生物合成、辅因子生物合成和氨基酸生物合成方面相对更高；拉赫曼在多样环境微生物代谢、双组分系统、碳代谢、ABC转运蛋白、群体感应和嘌呤代谢方面相对更高。所有宽泛类别比较均未达统计显著（p = 0.0809），仅构成方向性趋势。

4.6 氢、氮、碳、脂质及发酵代谢相关靶向代谢潜力

氢化酶相关基因方面，摄取氢化酶结构基因hupL和hupS及成熟基因hypA、hypB、hypD和hypF在拉赫曼平均相对占比更高，但FDR校正后均不显著。K00533（hydA）未在靶向表中检出，因hydA对应不同氢化酶类别且无单一通用KO标识，不能解释为不存在产氢氢化酶。固氮酶相关基因nifD、nifH、nifE、nifK和nifN在拉赫曼平均占比更高，校正后不显著。RuBisCO相关基因rbcL和rbcS在拉赫曼平均更高，校正后不显著。脂质代谢基因分布混合：accA、accC、accD、fabF、fabI和plsB在拉赫曼相对更高，fabD、fabG和plsC在琼扎更高。发酵相关基因方面，琼扎在hbd、crt和bcd上平均占比略高，adhE在拉赫曼略高，thl/atoB和etfA/etfB大致相当。光合作用相关KO丰度较低，校正后均不显著。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，两处受热影响基质群落呈现明显但统计上未确认的组成对比。琼扎的嗜盐/耐盐类群优势与其干旱盆地和矿化地下水背景一致，拉赫曼的土壤相关α-变形菌及酸杆菌门/疣微菌门谱系则符合较凉爽山地陆地界面的特征。由于缺乏匹配的重复水平地球化学测量，这些环境关联仅作为生态假说。两处位点共享广泛功能谱，支持群落水平功能冗余的可能性，但基因目录分析不能直接量化冗余程度。拉赫曼在氢化酶、固氮酶和RuBisCO相关基因上的平行高占比值得关注，但不能假定这些功能存在于同一生物体内，需基因组解析加以验证。研究局限性包括：每处仅3个空间重复限制统计功效；缺乏匹配的地球化学测量；宏基因组仅描述基因组潜力而非基因表达或代谢通量；功能分析基于基因目录而非MAG重建，无法将功能分配给特定微生物谱系。未来研究应结合扩大空间和时间采样、匹配水文化学表征、MAG重建、宏转录组分析及靶向实验测定。

研究结论部分：这项比较性鸟枪法宏基因组学研究表征了哈萨克斯坦琼扎与拉赫曼地热系统中受热影响基质相关的微生物群落。两处位点呈现明显的位点相关分类模式，包括属水平排序的明显分离，但位点间效应在当前重复数下未获得基于置换检验的统计支持。琼扎在物种丰富度上呈现方向性较高趋势，而香农多样性两处相近。尽管存在分类对比，宽泛功能谱大体共享。若干氢化酶、固氮酶、RuBisCO、脂质代谢、发酵和光合作用相关基因在相对占比上呈现方向性差异，但FDR校正后所有靶向KO比较均未保持显著。因此，这些发现识别出候选分类与功能模式，而非统计验证的位点特异特征。研究结果为哈萨克斯坦地热相关微生物群落提供了基线资源；未来纳入更大样本量、匹配地球化学测量、宏转录组学和基因组解析重建的研究将有助于确定所强调代谢功能的环境驱动因子、分类载体及活性。