基于GBS的湖南优良白檀（Symplocos paniculata）种质遗传关系、全果油脂变异与数量性状多样性分析

《Biology》：Genetic Relationships, Whole-Fruit Oil Variations, and Quantitative Trait Diversity in Elite Symplocos paniculata Accessions from Hunan Revealed by GBS

　　

白檀（Symplocos paniculata）是一种具有开发潜力的木本油料树种，但其遗传多样性以及全果、组织特异性油脂、脂肪酸和数量性状的联合变异仍未得到充分表征。研究人员利用基因分型测序（genotyping-by-sequencing, GBS）、全果及组织特异性油脂测定、脂肪酸谱分析和12个数量性状，对来自湖南省6个地理来源的30份优良种质进行了评价。共获得6335个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs），揭示了地理分化以及来源内显著的异质性。在排除一个高缺失率种质后，主多样性分析、主坐标分析（PCoA）、分子方差分析（AMOVA）和两两F_ST模式保持稳定。全果含油量平均为34.91%，范围为18.54%至51.35%，油酸为最主要的脂肪酸。一项额外的组织特异性试验显示，非种子组织的平均含油量高于种子组织（37.22%对30.32%），且脂肪酸组成存在明显差异。基于干物质质量加权的重建结果与实测全果含油量高度吻合（Pearson r = 0.935），表明全果变异反映了组织特异性油脂积累，而非仅由组织比例决定。在原始72项检验分析中，经地理来源或遗传结构校正后，合并的形态–油脂关联未保留Benjamini–Hochberg显著性。在单独的15项检验组织特异性再评估中，果序宽度与非种子组织含油量在合并、来源校正和遗传校正模型中均保持正相关。这些结果表征了所采样种质中互补的遗传和油脂相关变异，并确定了需要在重复的共同园和多点年际试验中独立验证的组织特异性关系。

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一、研究背景与问题

白檀（Symplocos paniculata (Thunb.) Miq.）是一种落叶灌木或小乔木，广泛分布于东亚和南亚地区，具有生态适应性强、观赏价值高以及作为果用木本油料资源的潜力。其果实的中果皮和种子均可积累油脂，成熟果实中高比例的不饱和脂肪酸支持其作为一种特色木本油料作物进行开发。然而，资源开发不能仅依赖平均含油量，还需要明确所采样种质是否代表了可用的遗传变异、脂肪酸组成是否存在分化，以及相关果实性状能否在栽培条件下被一致地评价和利用。

地理来源为种质采样提供了基本框架，但未必与遗传种群相对应。在长寿木本植物中，花粉和种子传播、局部建群、地形隔离以及种植材料的移动，都可能在形成区域分化的同时保留不同地点间的共享祖先。基因分型测序（genotyping-by-sequencing, GBS）可以在缺乏染色体级参考基因组的物种中提供大量单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）标记，从而解析复杂的遗传模式。然而，仅凭遗传信息并不能决定资源价值。全果含油量和脂肪酸组成定义了化学品质，而叶片、果序和果实性状描述了营养生长、繁殖和产量形成的可见维度。因此，种质保护和预育种需要将遗传、化学和数量性状证据综合起来考虑。

已有研究表明白檀果实中存在大量的油脂积累，并描述了主要脂肪酸和油脂沉积的发育变化；遗传研究也检测到区域种群内外的变异。但这些证据仍然零散，遗传关系、全果油脂性状和数量性状很少在同一组优良种质中联合分析。另一个问题是，在地理结构化的材料中，合并相关性可能混淆来源间差异与来源内个体间差异。在可见性状被用于优先筛选油脂评价材料之前，有必要区分整个样本中的协变关系与在地理或遗传结构被考虑后仍然存在的关联。

二、研究内容与结论

本研究以湖南省6个地理来源的30份白檀优良种质为材料，利用过滤后的GBS标记表征遗传多样性、分化程度、种质间关系及祖先组成；量化全果含油量和5种主要脂肪酸；并通过额外的组织特异性试验测定种子与非种子的干物质贡献、含油量及脂肪酸组成，以阐明它们对全果油脂变异的贡献；描述12个数量性状的主要模式；在合并分析以及经地理来源和遗传结构校正后，评估数量性状与油脂相关变量之间的关系。遗传结果的稳健性进一步通过位点过滤和个体缺失率敏感性分析加以评估。

研究得出以下主要结论：种质间存在明显的地理来源分化，同时来源内具有显著异质性；排除高缺失率种质后主要遗传模式保持稳定；种子与非种子组织在含油量和脂肪酸组成上均存在明显差异；干物质加权重建能够高度重现实测全果含油量，表明全果变异主要反映组织特异性油脂积累而非单纯的组织比例差异；原始合并分析中果实或果序性状与全果含油量的关系经地理或遗传结构校正后不再具有多重检验显著性，但果序宽度与非种子组织含油量在组织特异性再评估中保持显著正相关，是值得独立验证的候选关联。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：其一，GBS技术，利用限制性内切酶ApeKI酶切基因组DNA，构建GBS文库并进行Illumina NovaSeq 6000双端150 bp测序，经Stacks聚类、BWA比对和GATK变异检测获得SNP标记；其二，索氏抽提法（Soxhlet extraction）按照GB 5009.6-2016测定全果含油量，并采用气相色谱法（gas chromatography, GC）按照GB 5009.168-2016测定脂肪酸组成；其三，组织特异性分析，将每份种质的成熟果实分为种子和非种子两部分，分别测定干物质比例、含油量和脂肪酸组成，并通过干物质加权重建全果含油量；其四，群体遗传学分析，包括主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）、邻接法（neighbor-joining, NJ）系统发育树、分子方差分析（analysis of molecular variance, AMOVA）、两两F_ST估计以及ADMIXTURE祖先成分分析；其五，统计建模，采用Kruskal–Wallis检验、Benjamini–Hochberg多重检验校正、Spearman秩相关、地理来源和遗传结构校正的残差相关分析以及分层bootstrap置信区间评估性状间关系。样本采集自湖南省长沙（C）、大围山（D）、道县（DX）、衡山（H）、龙山（L）和岳阳（Y）6个地理来源，每来源5株，共计30份优良单株。

四、研究结果

（一）采样框架与GBS数据质量

30份白檀种质代表了湖南省6个地理来源，每来源5份。采样点分布在109.333°至114.150°E、25.400°至29.367°N之间，海拔78–1550 m。GBS共产生95.55 Gb原始序列数据，过滤后保留95.20 Gb，获得671,519,072条清洁读段，平均每份种质3.17 Gb。原始变异检测共获得1,971,135个位点，包括1,935,147个SNP和35,988个InDel。经基因型检出率≥80%和最小等位基因频率≥0.05的过滤后，最终保留6335个SNP用于后续分析。在所有9种检出率和MAF阈值组合下，遗传距离矩阵与参考矩阵的相关系数为0.961至0.999，主要排序模式保持稳定。

（二）遗传多样性、分化与祖先模式

来源水平多样性指数在各地理来源间存在差异。龙山来源的观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和多态性信息含量（PIC）最高，分别为0.115、0.225和0.180；大围山来源最低，分别为0.024、0.099和0.078。所有来源的Ho均低于He。AMOVA将33.38%的遗传变异归因于地理来源间差异，66.62%归因于来源内变异，整体分化系数Φ_ST = 0.3338（p = 0.0001）。15个来源对的F_ST范围为?0.005至0.568，其中8对在Benjamini–Hochberg校正后仍显著。PCoA显示30份种质形成部分连续的分布而非6个完全分离的离散群组。NJ树同样显示部分末端群组包含同一来源的种质，但主要分支包含多个来源的种质。ADMIXTURE分析中K = 8对应交叉验证误差最小值，仅作探索性精细尺度呈现。排除高缺失率种质L5后重新过滤得到5672个SNP，敏感性PCoA与参考排序高度一致（PCoA1和PCoA2坐标相关系数分别为0.99984和0.99956），AMOVA将34.91%的变异归因于来源间差异，主要遗传结论未因该种质的缺失而改变。

（三）全果含油量和脂肪酸组成变异

30份种质的全果含油量范围为18.54%至51.35%，平均34.91%，中位数34.42%，变异系数27.18%。各来源平均含油量以大围山最高（43.63%），岳阳最低（27.14%），Kruskal–Wallis检验表明来源间差异显著（p = 0.0143）。5种主要脂肪酸中，油酸（C18:1）相对含量最高，平均48.53%，棕榈酸（C16:0）为26.24%，亚油酸（C18:2）为22.01%，硬脂酸（C18:0）和α-亚麻酸（C18:3）分别为1.03%和1.46%。饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）平均值分别为27.28%、48.53%和23.47%，经多重检验校正后来源间差异均未达到q < 0.05的显著水平。

（四）组织特异性含油量和脂肪酸组成

在额外的组织特异性试验中，种子干物质比例平均为46.62%，非种子为53.38%。种子含油量平均为30.32%，非种子为37.22%，非种子含油量在27份种质中高于种子，平均配对差异为6.90个百分点，配对Wilcoxon符号秩检验差异极显著（p < 0.001）。脂肪酸组成方面，种子油中C18:1和C18:2的平均比例高于非种子油（52.35%对38.27%，31.79%对23.83%），而非种子油中C16:0、C18:0和C18:3的比例更高（33.30%对12.76%，1.52%对1.30%，1.95%对1.02%），5项组织比较在多重检验校正后均显著。基于干物质质量加权重建的全果含油量平均为34.02%，与同一试验中直接实测的33.98%高度吻合（Pearson r = 0.935，p < 0.001），平均绝对误差为0.594个百分点，实测与重建差值不显著异于零（p = 0.731）。

（五）数量性状变异与多变量表型结构

12个数量性状在30份种质中均存在变异。果实座果率（FS）和果序宽度（IW）的变异系数最大，分别为48.18%和47.97%；果序果实数（FPI）、叶面积（LA）和果序果质量（FMI）的变异系数分别为32.80%、32.14%和31.39%。主成分分析中，PC1和PC2分别解释了标准化性状变异的35.2%和23.8%。经12项检验的联合校正后，7个性状在来源间差异显著（q < 0.05），包括果序宽度（IW）、果实纵径（FLD）、果实横径（FTD）、叶长（LL）、叶宽（LW）、叶柄长（PL）和叶面积（LA）。

（六）数量性状与油脂相关变量在来源和遗传结构校正前后的关系

在原始合并分析中，12个数量性状与6个油脂相关变量共72个组合中，9个在Benjamini–Hochberg校正后保持显著，其中5个涉及全果含油量。果序宽度（IW）、果实横径（FTD）和果实纵径（FLD）与全果含油量的合并Spearman ρ值最高，分别为0.636、0.635和0.632。经地理来源校正后，IW、FTD和FLD与全果含油量的残差相关系数分别降至0.372、0.270和0.189；经PCoA1和PCoA2校正后分别为0.503、0.511和0.485。尽管系数方向保持为正，但两组校正分析中均无任何关系在校正后仍具Benjamini–Hochberg显著性。分层bootstrap分析显示校正后关系存在较大不确定性。

在独立的组织特异性再评估中，果序宽度（IW）与非种子含油量在合并分析中呈显著正相关（Spearman ρ = 0.555，q = 0.0218），在来源校正后（残差r = 0.570，q = 0.0153）和遗传校正后（残差r = 0.556，q = 0.0211）均保持显著。果实纵径（FLD）、果实横径（FTD）和果序宽度（IW）与种子干物质比例和种子含油量在三种模型中均无显著关系。

五、讨论与结论

讨论部分指出，30份白檀优良种质表现出可测量的地理来源间遗传分化以及来源内的大量变异。AMOVA将33.38%的遗传变异归因于来源间差异，两两F_ST从接近于零到0.568不等，PCoA和NJ树显示了部分地理聚类但未完全按来源分离。这表明地理来源捕获了所采样材料中的部分遗传结构，但并未定义6个离散的遗传种群。个体缺失率敏感性分析证实主要遗传结论并非由高缺失率种质L5驱动。

全果含油量和脂肪酸组成在30份种质中表现出显著变异，油酸为最丰富的脂肪酸，不饱和脂肪酸约占所测谱的72%。组织特异性试验表明，非种子组织平均含油量高于种子，两组织在脂肪酸组成上差异明显。重要的是，组织比例本身并不能解释全果含油量变异：种子干物质比例与实测全果含油量无显著关联，而干物质加权重建能高度重现实测整果含油量。这表明全果含油量的种质间变异同时反映了组织特异性油脂浓度以及两组织比例的相对贡献。

合并相关性分析易受遗传结构影响。原始合并分析中最强的全果含油量相关性涉及果序宽度、果实横径和果实纵径，但经地理来源或遗传结构校正后均不再显著。组织特异性再评估中，果序宽度与非种子含油量的正向关系在合并、来源校正和遗传校正三种模型中均保持显著，而果实纵径、果实横径和果序宽度与种子干物质比例或种子含油量均无显著关系。这些结果提示非种子组织的油脂积累可能与果序宽度的关联更为直接，但该关系仍属观察性发现，尚不能确立因果关系。

研究结论指出，通过整合6335个GBS来源的SNP、全果和组织特异性油脂性状、脂肪酸组成以及12个数量性状，本研究表征了来自湖南省6个地理来源的30份白檀优良种质的遗传和表型变异。来源间遗传分化伴随显著的来源内异质性，主要PCoA、多样性、AMOVA和两两F_ST模式在排除高缺失率种质后保持稳定。组织特异性分析显示种子和非种子组织在含油量和脂肪酸组成上均存在差异，干物质加权重建高度重现实测全果含油量，表明全果变异反映组织特异性油脂积累而非仅由组织比例决定。原始合并分析中果实或果序性状与全果含油量的关系经地理来源或遗传结构校正后未保留Benjamini–Hochberg显著性；然而果序宽度与非种子含油量的关系在单独的组织特异性合并、来源校正和遗传校正分析中保持显著，因此是独立验证的候选指标而非已验证的选择标准。总体而言，所采样种质包含互补的遗传和油脂相关变异，但将其用于保护和育种时，应优先考虑直接化学测定和更广泛的种质代表性，随后进行重复共同园和多点年际验证，之后才能进行稳定的供体或亲本分配。