《Agronomy》：Antifungal Activity of Leaf Essential Oil and Its Endophytic Fungi of Camphora bodinieri with Citral Chemotype Against Rhizoctonia solani
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摘要专业翻译
本研究旨在探究柠檬醛化学型檫木（Camphora bodinieri with citral chemotype, CBCC）叶片精油及其内生真菌对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）——水稻纹枯病的致病菌——的抑制效果及作用机制。
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本研究旨在探究柠檬醛化学型檫木（Camphora bodinieri with citral chemotype, CBCC）叶片精油及其内生真菌对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）——水稻纹枯病的致病菌——的抑制效果及作用机制。研究人员通过测定不同浓度下的抑制率来评估其抗真菌活性，并利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察病原菌的超微结构变化。在CBCC檫木精油处理组中，最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为1.0 μL/mL，抑制率达100%，且表现出浓度依赖性效应（0.0625–1.0 μL/mL范围内，抑制率为29.02%–100%）。电子显微镜观察显示，精油对菌丝细胞膜造成严重损伤，引起细胞质凝聚和细胞器崩解；而内生真菌处理仅导致局部皱缩和部分变形。CBCC精油与内生真菌均表现出抗真菌活性，二者有望成为水稻纹枯病生物防治的候选资源，具有开发生物杀菌剂的潜力。
论文解读文章
一、研究背景与意义
水稻纹枯病是由土传真菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的一种毁灭性全球病害，是水稻生产中最具破坏性的真菌威胁之一。该病原菌的菌核结构赋予其极强的环境适应能力和持续侵染性，寄主范围广泛，可侵染约200种经济作物，严重流行时可造成高达50%的产量损失，对全球粮食安全构成严重威胁。目前，水稻纹枯病的防治主要依赖化学杀菌剂，但长期不合理使用导致病原菌抗药性增强，同时带来环境污染和农药残留风险。因此，开发高效、低毒、环境友好的新型抗真菌制剂已成为植物病理学研究的重要方向。
植物精油（essential oils, EOs）由芳香植物天然产生，含有多种具有生物活性的挥发性分子，其抗氧化、抗菌和抗炎特性已在传统医学、化妆品和食品工业中得到广泛应用。近年来，多项研究报道了不同植物精油对立枯丝核菌的抑制活性。然而，已有研究主要集中在薄荷、百里香、柠檬草和肉桂等常见精油，或直接评价柠檬醛（citral）、百里香酚（thymol）等单一化合物，对于柠檬醛化学型檫木（Camphora bodinieri with citral chemotype, CBCC）叶片精油的研究尚属空白。该精油对立枯丝核菌的直接抗真菌活性、发挥作用的生物活性成分及其作用机制，以及其内生真菌代谢产物的抗真菌特性，均有待阐明。
檫木（Camphora bodinieri）为中国樟属（Camphora）所特有，其中柠檬醛化学型（CBCC）富含柠檬醛。已有研究表明柠檬醛是优良的抗真菌化合物，但CBCC叶片精油及其内生真菌代谢产物对立枯丝核菌的直接抗真菌活性鲜有研究。因此，本研究旨在系统评估这一主题，并初步探索其潜在作用机制，为水稻纹枯病的绿色防控提供新的候选资源，为拓展CBCC精油的农业应用提供科学依据。
二、主要关键技术方法
研究人员采用水蒸气蒸馏法从CBCC新鲜叶片中提取精油，并利用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）分析其化学成分。抗真菌活性评估采用含药培养基梯度稀释法和琼脂稀释法测定抑制率及最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）。内生真菌对立枯丝核菌的拮抗作用采用对峙培养法（dual-culture method）评估。超微结构变化通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）和透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察。病原真菌立枯丝核菌由江西农业大学国家林业和草原局木本香料重点实验室提供；CBCC植物材料为江西省审定良种（良种编号：赣S-SC-CB-001-2023）；内生真菌菌株CPY19由研究人员前期从檫木中分离纯化获得，保存于江西省樟树繁育开发与利用产业技术工程中心。
三、研究结果
3.1 柠檬醛化学型檫木精油的化学成分
GC-MS分析结果显示，CBCC叶片精油为淡黄色透明液体，具有 distinctive 柠檬香气，出油率为0.189 ± 0.022%。通过与柠檬醛标准品总离子流色谱图对比，精油中两个主要色谱峰分别对应橙花醛（neral，顺式柠檬醛）和香叶醛（geranial，反式柠檬醛），相对含量分别为18.32%和23.47%，柠檬醛总相对含量达41.79%，占据绝对优势地位，证实该种质资源属于典型的柠檬醛化学型。
3.2 柠檬醛化学型檫木叶片精油的抗真菌效果
精油对立枯丝核菌表现出强抑制活性，且呈浓度依赖性。最高浓度1.0 μL/mL时抑制率达100%，最低浓度0.0625 μL/mL时抑制率为29.02 ± 0.68%。各浓度抑制率分别为：0.125 μL/mL为30.59 ± 4.24%，0.25 μL/mL为58.43 ± 5.31%，0.5 μL/mL为94.11 ± 0%。两性霉素B（amphotericin B）阳性对照的抑制率为95.29 ± 2.36%。统计分析表明，0.0625与1.0 μL/mL之间存在显著差异，而0.0625与0.125 μL/mL之间差异不显著，说明两个较低浓度仅产生弱抑制效果。
3.3 最小抑菌浓度测定及对峙培养法抑菌效果
采用梯度稀释法制备含精油培养基，浓度设置为0.5、1.0、2.0和4.0 μL/mL。培养7天后，CBCC精油对立枯丝核菌的最小抑菌浓度（MIC）确定为1.0 μL/mL。对峙培养实验显示，含柠檬醛的内生真菌对立枯丝核菌的抑制率达82.74 ± 0.68%，属于高效抑制（抑制率≥75%）。
3.4 扫描电子显微镜观察精油和真菌对立枯丝核菌的影响
SEM观察显示，对照组菌丝表面光滑平整、粗细相对均匀、形态饱满，无明显塌陷或断裂。内生真菌对峙处理组菌丝表面粗糙皱缩，出现局部缢缩、扭曲或粗细不均，部分菌丝轻微塌陷。精油处理组菌丝损伤更为严重，表面高度粗糙，广泛干瘪、皱缩并出现纵向凹陷，部分菌丝断裂，可见类似细胞内容物的局部泄漏。结果表明两种处理均能破坏菌丝表面结构，但精油造成的损伤更为严重。
3.5 透射电子显微镜观察精油和真菌对立枯丝核菌的影响
TEM观察显示，对照组菌丝细胞结构相对完整，细胞壁与细胞膜边界清晰，细胞质分布均匀，无明显大液泡或内容物聚集。内生真菌对峙处理后，菌丝细胞出现局部细胞膜皱缩或断裂、细胞质分布不均、细胞内出现液泡或电子透明区域，但细胞壁结构相对完整。精油处理组细胞损伤进一步加剧：细胞壁仍可见，但细胞膜结构不完整，细胞质明显凝聚且电子密度增高，细胞内出现大液泡，内容物分布紊乱。超微结构变化表明精油对病原菌细胞结构的破坏程度大于内生真菌对峙处理。
四、讨论与结论
讨论部分总结： 本研究中CBCC叶片精油的柠檬醛含量为41.79%，对立枯丝核菌具有显著抑制效果，MIC为1.0 μL/mL，与已有文献报道的柠檬醛类化合物抗真菌活性结果相近。不同植物精油对立枯丝核菌的抑制效果差异较大，可能与其主要活性成分、组分间的协同或拮抗作用以及病原菌敏感性差异有关。精油处理引起的菌丝皱缩、细胞膜损伤、细胞质凝聚和细胞器崩解等超微结构变化，与柠檬醛破坏尖孢镰刀菌细胞膜完整性和通透性的研究结果一致。精油中多种次级代谢产物（如萜烯类、酚类、醇类和醛类）可能同时作用于细胞壁、细胞膜、细胞质和DNA等多个靶点。内生真菌的抗真菌作用可能更多依赖于其代谢产物的种类、分泌水平和浓度，以及与病原菌之间的竞争或重寄生作用，具体活性代谢物尚待鉴定。精油与内生真菌处理属于不同的实验体系，其数值抑制率不可直接比较。
研究结论： 本研究证明，CBCC叶片精油（柠檬醛含量41.79%）在体外条件下对立枯丝核菌表现出强抗真菌活性，MIC为1.0 μL/mL，抑制率达100%，且抑制率随精油浓度升高而增加。扫描和透射电子显微镜结果表明，精油破坏了细胞壁和细胞膜的完整性，造成严重的超微结构损伤。在对峙培养实验中，内生真菌处理的抑制率为82.74%，电镜观察显示该处理主要引起局部细胞皱缩。这些发现为樟属植物精油和内生真菌在水稻纹枯病防治中的潜在应用提供了初步理论依据。然而，本研究主要局限于体外条件，缺乏温室和田间验证；内生真菌仅通过对峙培养法评估，尚不能反映实际防病效果；菌株CPY19缺乏ITS序列鉴定和明确的分类学地位；精油仅来自单批次提取，批次间化学成分差异无法评估。未来研究应结合化学成分表征、制剂开发、温室和田间药效试验、体内药效测试及安全性评价，并进一步验证精油与内生真菌联合应用的潜力。
