X射线辐照减毒艾美耳球虫卵囊免疫山羊羔球虫病的田间试验研究

《Vaccines》：Field Studies on Immunization of Goat Kids Against Coccidiosis Using X-Radiation-Attenuated Oocysts of Different Eimeria Species

　　

背景/目的：山羊球虫病由艾美耳属（Eimeria spp.）寄生虫引起，是影响山羊健康和生产的重要寄生虫病，当前控制策略主要依赖抗球虫药物。耐药性的出现以及对可持续替代方案的需求凸显了开发有效免疫预防方法的重要性。本研究旨在评估X射线减毒艾美耳球虫卵囊在山羊球虫病田间条件下的免疫保护效果，并确定疫苗接种对寄生虫负荷、临床结局和生产性能的影响。方法：研究人员利用从同一农场自然感染山羊获得的减毒卵囊开展了一项田间研究。鉴定出的主要艾美耳球虫种类包括E. christenseni、E. arloingi和E. ninakohlyakimovae。研究人员进行了三个连续试验以优化免疫方案。1–6周龄的山羊羔接受不同免疫处理，剂量范围为5 × 103至6 × 104个经X射线辐照（10–30 kRad，即100–300 Gy）减毒的孢子化卵囊。研究人员每周监测动物体重、粪便稠度、健康状况、粪便卵囊排出量及艾美耳球虫种类组成。结果：使用辐射减毒卵囊进行疫苗接种减少了寄生虫复制和粪便卵囊排出，尤其影响了高致病性物种如E. ninakohlyakimovae，同时维持了整体艾美耳球虫物种多样性。临床保护主要体现在寄生虫压力降低，而非完全预防轻度腹泻。生产参数未显著改善，表明疫苗接种的主要益处在于改善寄生虫控制和减少环境污染。结论：早期施用X射线减毒艾美耳球虫卵囊代表了控制山羊球虫病的一种有前景的策略。疫苗效力取决于合适的时机选择和减毒条件的优化。需要进一步研究免疫机制、物种特异性保护以及在商业化养殖条件下的表现，以支持开发用于山羊生产的可持续疫苗。

一、研究背景与科学问题

山羊球虫病是由艾美耳属（Eimeria spp.）多种寄生虫引起的肠道寄生性疾病，全球范围内的山羊养殖场均受其影响。目前已描述超过15种感染山羊的艾美耳球虫，其中E. ninakohlyakimovae和E. arloingi被认为高度致病且最为流行，而E. christenseni和E. caprina则具有中等致病性。这些胞内寄生虫定殖于肠上皮细胞，通过在性生殖和无性生殖阶段破坏宿主细胞导致病理损伤。临床症状多见于羔羊，表现为水样粪便伴黄至黑褐色黏液，可引起体重下降和脱水。抗球虫药物的使用成本及相关死亡率和生产参数下降是造成经济损失的主要原因。

当前山羊球虫病的控制依赖于管理措施与抗球虫药物的联合应用。然而，多数国家对药物使用的限制日益严格，且抗药性报告愈发频繁。因此，过去十年间对包括免疫预防在内的替代控制策略的兴趣不断增长。在家禽业已有多种商品化活疫苗或减毒活疫苗上市，但针对反刍动物的同类研究较少。此前，Ruiz等已证明使用X射线减毒卵囊免疫山羊羔可诱导针对E. ninakohlyakimovae的保护性免疫反应，但单种感染在田间几乎不存在，且免疫力主要为物种特异性。为此，研究人员尝试开发包含多种致病性艾美耳球虫的疫苗，但初步结果表明免疫保护不如单种疫苗明显。基于此，本研究旨在通过田间试验优化使用X射线减毒混合艾美耳球虫卵囊的免疫方案，重点考察免疫年龄、减毒程度和免疫剂量等因素。

二、主要技术方法

研究人员从同一农场的自然感染山羊收集粪便样本，采用饱和糖溶液漂浮法纯化卵囊，并在室温下于2%重铬酸钾溶液中孵育一周完成孢子化。通过改良麦克马斯特（McMaster）计数法和形态学标准鉴定三种主要艾美耳球虫（E. ninakohlyakimovae、E. arloingi和E. christenseni）的比例，并按等比例混合制备免疫原。卵囊经无菌蒸馏水洗涤后，在西门子直线加速器上进行X射线辐照减毒，辐照剂量分别为10、20或30 kRad（100、200或300 Gy）。研究在西班牙大加那利岛的一个商业化山羊养殖场进行，该农场饲养约5030头山羊（主要为Majorera品种）。共设计三个连续试验，总计纳入约259只雌性山羊羔，分别在不同周龄（1–6周）接受不同剂量（5×10³至6×10⁴个卵囊）和不同辐照强度的免疫处理。所有动物在自然感染条件下饲养，不使用抗球虫药物，每周监测至14周龄。

三、研究结果

3.1 卵囊计数

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  第一次试验：3周龄免疫的动物在5–6周龄达到卵囊排出高峰，其中20M-20K组（2×10⁴个卵囊，20 kRad辐照）和10M-20K组的卵囊排出减少最明显（分别约60%和40%），但未达统计学显著性。4周龄免疫效果减弱，5或6周龄免疫几乎无效果。
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  第二次试验：1或2周龄免疫的动物在6周龄达到卵囊排出高峰，所有免疫组均低于对照组，其中60M-10K组（6×10⁴个卵囊，10 kRad辐照）在2周龄免疫时卵囊曲线下面积（AUC）减少73%，差异具有统计学意义（p < 0.01）。
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  第三次试验：2周龄免疫的动物中，20M-20K组在6周龄卵囊排出高峰时显著低于对照组（p < 0.05），AUC减少约10–25%。

3.2 艾美耳球虫种类分布

整个研究中，E. christenseni是最优势物种（频率约50–80%），其次为E. arloingi（约10–45%），E. ninakohlyakimovae为中低频率。免疫动物中，E. arloingi和E. ninakohlyakimovae的累积流行率分别下降6.0%和31.7%，而E. christenseni略有增加（+5.2%），表明疫苗接种降低了高致病性物种的感染强度。

3.3 临床参数

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  粪便稠度：三个试验中超过50%的动物粪便正常（评分1），约25%为评分2，不足10%出现评分3或4。第二次试验中免疫动物评分2的频率明显低于对照组。首次试验中5周龄免疫组总体粪便评分显著低于对照组（p < 0.05），而第二次和第三次试验中2周龄免疫组评分反而较高。
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  污秽评分：超过50%的动物无污秽，约30%出现干性污秽，不足10%出现湿性污秽。5或6周龄免疫的动物干性和湿性污秽均少于对照组，而早期免疫的效果不一致。

3.4 生产参数

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  体重：各组体重增长趋势高度相似，从初期的约4–5 kg增至试验结束时（8–14周龄）的8–13 kg，仅在极少数组别中观察到显著差异。
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  增重率：三个试验的整体增重模式相似，出现三个主要生长峰值（2–3周龄、5–6周龄和8–9周龄）。第二次试验中免疫动物在6–8周龄持续表现出更高增重率，仅在最后一次采样点达到显著性（p < 0.05）。第三次试验中20M-20K组在4–5周龄间的增重率显著高于对照组（p < 0.05）。

四、讨论与结论

本研究表明，在田间条件下使用辐射减毒多物种艾美耳球虫卵囊疫苗可显著减少寄生虫复制和累积卵囊排出，尤其是在生命最初几周施用时效果最佳。这一保护效应与此前家禽及反刍动物中的研究报告一致。卵囊排出的减少是最明确的疫苗效力指标，最高可达73%的AUC减少。宿主年龄是关键决定因素，早期免疫（1–2周龄）效果远优于后期免疫（5–6周龄），这可能与宿主免疫系统成熟度和疫苗生物学特性有关。疫苗配方同样影响保护水平，2×10⁴个卵囊配合20 kRad辐照的组合始终表现最优。辐照剂量需在寄生虫活力与安全性之间取得平衡，20 kRad在本系统中优于10 kRad。

尽管疫苗显著降低了寄生虫输出，但对临床指标和生产性能的影响有限，这可能是由于研究条件下感染压力适中且优势物种E. christenseni致病性较低所致。重要的是，疫苗接种未对生产性能产生负面影响，支持了该减毒疫苗的安全性。疫苗的主要价值可能体现在长期降低环境污染和传播压力，从而间接减少后续批次的疾病负担和抗球虫药物的使用需求。

结论翻译：总之，本研究表明，在自然田间条件下，辐射减毒的多物种艾美耳球虫卵囊可有效减少山羊羔的寄生虫复制和累积卵囊排出，尤其是在生命早期施用时。尽管需要详细分析与免疫保护相关的免疫应答，但艾美耳球虫群落结构的保持以及寄生虫输出的减少表明，疫苗接种控制了感染强度，同时允许自然免疫力的发展。尽管在所评估的条件下临床和生产效益有限，但寄生虫排泄的大幅减少意味着通过降低环境污染和传播产生了有意义的流行病学影响。这些发现支持将辐照多物种艾美耳球虫疫苗作为控制山羊球虫病的一种有前景且可持续的策略。