《Journal of Oral Microbiology》：Effects of Berberine chloride hydrate on cariogenic multispecies streptococcal biofilm
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**背景** 龋病是一种与生物膜相关的细菌感染性疾病，其发生是由于致龋菌比例较共生菌比例增加所致。本研究旨在构建由血链球菌（*S. sanguinis*）、戈登链球菌（*S. gordonii*）和变异链球菌（*S. mutans*）组成的体外生物膜模型，
**背景** 龋病是一种与生物膜相关的细菌感染性疾病，其发生是由于致龋菌比例较共生菌比例增加所致。本研究旨在构建由血链球菌（*S. sanguinis*）、戈登链球菌（*S. gordonii*）和变异链球菌（*S. mutans*）组成的体外生物膜模型，以研究盐酸小檗碱水合物（Berberine chloride hydrate, BH）对多菌种生物膜结构及致龋特性的影响。
**材料与方法** 观察多菌种链球菌生物膜的形成及其致龋特性。利用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）定量多菌种生物膜中的微生物组成。此外，进行转录组分析，以确定在有无BH条件下多菌种生物膜内各菌株基因的差异表达水平。采用微型计算机断层扫描（micro-CT）分析经BH处理的生物膜的脱矿活性。
**结果** BH对*S. mutans*的抗菌效果最强，其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低生物膜抑菌浓度（minimum biofilm inhibitory concentration, MBIC）值均低于*S. sanguinis*和*S. gordonii*。BH抑制了多菌种生物膜的形成以及胞外多糖（exopolysaccharides, EPS）的合成，导致牛牙釉质表面脱矿减少。此外，经BH处理后，*S. sanguinis*和*S. mutans*的丰度降低，而*S. gordonii*的丰度升高。
**结论** BH在致龋性生物膜的管理方面显示出巨大潜力，表明其可能在龋病治疗中具有应用前景。
**关键信息** BH对*S. mutans*的抗菌效果最强，其MIC和MBIC值均低于*S. gordonii*和*S. sanguinis*。BH抑制了多菌种生物膜的形成以及EPS合成。经BH处理的多菌种生物膜在生物膜/牙釉质界面的脱矿活性降低。BH改变了多菌种生物膜的组成，使*S. gordonii*胜过*S. sanguinis*和*S. mutans*。
## 论文解读文章
### 研究背景与目的
龋病是一种与生物膜相关的细菌感染性疾病，源于牙菌斑生物膜的微生态失衡。全球疾病负担研究显示，口腔疾病患者数量庞大，其中未治疗的恒牙龋病占相当比例。牙菌斑生物膜由多种细菌和细胞外基质组成，在健康状态下各菌群保持生态平衡；当环境因素或菌间相互作用打破这种平衡，嗜酸耐酸菌如变异链球菌（*Streptococcus mutans*）比例升高，导致胞外基质合成增加、微环境酸化，最终引发釉质脱矿和龋损形成。因此，抑制致龋菌的定植和毒力是龋病预防的关键。牙菌斑生物膜的形成始于口腔链球菌的定植，血链球菌（*Streptococcus sanguinis*）和戈登链球菌（*Streptococcus gordonii*）常见于无龋牙面，它们通过精氨酸脱亚胺酶系统代谢精氨酸，降低龋病风险，并与*S. mutans*存在竞争和拮抗关系。鉴于生物膜的复杂微生态，寻找能够选择性靶向致龋菌而不影响共生菌的抗菌剂至关重要。盐酸小檗碱水合物（Berberine chloride hydrate, BH）是从中药黄连中提取的天然生物碱，具有多种分子靶点、临床应用安全、治疗剂量下毒性低等特点。研究人员前期已证明BH对*S. mutans*单菌种生物膜具有有效抗生物膜活性，但其对*S. sanguinis*、*S. gordonii*和*S. mutans*组成的多菌种生物膜的影响尚未见报道。本研究旨在构建三菌种体外多菌种生物膜模型，探讨BH对生物膜结构、菌群组成、致龋特性及釉质脱矿的影响，并初步阐明其作用机制。
### 研究开展与主要结论
研究人员构建了由*S. sanguinis*、*S. gordonii*和*S. mutans*以1:1:1比例混合的体外多菌种生物膜模型，在有无BH条件下培养，系统评价了BH对浮游菌生长、生物膜形成、成熟生物膜代谢活性、生物膜三维结构、胞外多糖合成、产酸能力、菌群组成、基因表达谱及釉质脱矿的影响。研究发现，BH对*S. mutans*的抑制作用最强，MIC和MBIC值均低于另外两种链球菌；BH可抑制多菌种生物膜形成、降低EPS合成和乳酸产量，减少牛牙釉质表面脱矿；BH还改变了菌群组成，使*S. gordonii*在竞争中胜出，*S. mutans*和*S. sanguinis*相对丰度降低。转录组分析显示BH干扰了碳水化合物代谢和核糖体功能相关基因的表达。该研究为BH作为生态学龋病管理候选药物提供了实验依据。
### 主要技术方法
研究中使用的菌株为*S. sanguinis*（ATCC 10556）、*S. mutans* UA159（ATCC 700610）和*S. gordonii*（DL-1），均来自实验室保存。通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）；结晶紫染色和MTT法评估生物膜形成量及成熟生物膜代谢活性；扫描电镜（SEM）观察生物膜形态；激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）结合SYTO9/碘化丙啶活死染色及Alexa Fluor 647标记葡聚糖染色分析生物膜厚度、活死比例和EPS分布；荧光原位杂交（FISH）定量生物膜中三种菌的丰度和比例；苯酚-硫酸法测定水不溶性EPS；乳酸测定试剂盒和pH电极分别检测乳酸产量和培养液pH值；转录组测序分析差异表达基因并富集GO和KEGG通路；利用牛牙釉质块构建体外脱矿模型，应用micro-CT评估病变深度和矿物密度。
### 研究结果
#### BH对三种链球菌表现出不同的抗菌作用
通过测定浮游菌的MIC发现，BH对*S. mutans*的MIC为64 μg/mL，对*S. sanguinis*和*S. gordonii*的MIC分别为256 μg/mL和128 μg/mL，表明BH对*S. mutans*具有最高的抗菌效力。
#### BH对多菌种链球菌生物膜具有良好的抗菌活性
结晶紫染色结果显示，128 μg/mL BH可显著减少*S. sanguinis*、256 μg/mL BH减少*S. gordonii*、64 μg/mL BH减少*S. mutans*的生物量，128 μg/mL BH显著抑制多菌种生物膜形成；BH对*S. mutans*的MBIC值低于其他两种菌。MTT实验显示256 μg/mL BH可显著降低三种单菌种及多菌种成熟生物膜的代谢活性。SEM观察证实128 μg/mL BH显著降低多菌种生物膜总生物量；CLSM活/死染色显示BH处理组死菌比例升高、生物膜厚度减小。
#### BH抑制多菌种链球菌生物膜的致龋特性
CLSM结果显示，64和128 μg/mL BH均抑制EPS合成，EPS与细菌的比例降低；苯酚-硫酸法定量证实128 μg/mL BH显著减少水不溶性EPS含量。同时，128 μg/mL BH显著降低乳酸产量，并降低培养介质的pH值，表明BH可削弱生物膜的致龋潜力。
#### BH改变多菌种链球菌生物膜的微生物组成
FISH分析表明，BH处理后，生物膜中*S. sanguinis*、*S. gordonii*和*S. mutans*的生物量均下降；但128 μg/mL BH显著降低了*S. mutans*和*S. sanguinis*的相对丰度，同时增加了*S. gordonii*的相对丰度，提示BH在多菌种生物膜中选择性抑制致龋菌和部分共生菌，使*S. gordonii*获得竞争优势。
#### BH处理的多菌种链球菌生物膜转录组分析
主成分分析显示BH处理组与对照组明显区分。差异表达基因分析显示，*S. mutans*中371个基因下调和271个上调；*S. sanguinis*中134个基因上调和54个下调；*S. gordonii*中302个基因下调和497个上调。GO富集分析显示差异基因主要涉及生物学过程的细胞过程和代谢过程、细胞组分中的细胞及细胞部分、分子功能中的催化活性和结合活性。KEGG富集分析显示，碳水化合物代谢是三种菌共有的主要改变通路；核糖体通路在三种菌中均显著富集，此外*S. mutans*的碳代谢和*S. sanguinis*的氨酰-tRNA生物合成也被富集。
#### BH减弱生物膜诱导的釉质脱矿
在牛牙釉质多菌种生物膜脱矿模型中，micro-CT扫描显示，BH处理组的脱矿病变深度显著低于对照组，脱矿区矿物密度高于对照组（尽管差异未达到统计学显著），表明BH可降低生物膜介导的釉质脱矿活性。
### 讨论总结与研究结论
讨论部分指出，龋病的发生与微生物生态失衡密切相关，多菌种生物膜模型是龋病研究的常用工具。本研究发现BH对致龋菌*S. mutans*的抑制作用强于对共生菌的作用，且多菌种生物膜对BH的耐受性高于单菌种生物膜。BH抑制EPS合成可能是细菌在应激条件下减少胞外基质产生的生存策略。菌群组成的变化可能与BH抑制*S. mutans*后*S. gordonii*获得相对竞争优势有关，*S. gordonii*本身在结合位点竞争中具有较高竞争力，并可能通过增强过氧化物酶产生能力抑制条件致龋菌的增殖。转录组分析提示BH可能通过干扰碳水化合物代谢减少乳酸产生，并可能靶向核糖体影响多种细菌的蛋白质合成。micro-CT作为体外龋损评价的金标准，结合牛牙釉质模型验证了BH的抗脱矿作用。研究局限性在于机制探索尚处初步阶段，需进一步实验阐明，并需体内实验验证临床转化潜力。
**研究结论**：综上所述，本研究表明，BH可抑制由*S. sanguinis*、*S. gordonii*和*S. mutans*组成的多菌种生物膜的形成及EPS合成，改变其微生物结构；BH处理的多菌种生物膜在生物膜/牙釉质界面的脱矿活性降低。总之，BH在致龋性生物膜的管理方面显示出巨大潜力，表明其可能在龋病治疗中具有应用前景。
