具核梭杆菌外膜囊泡在疾病中的作用及相关机制：致病机制与潜在治疗应用的范围综述

《Journal of Oral Microbiology》：The role of Fusobacterium nucleatum outer membrane vesicles in disease and related mechanisms: a scoping review of pathogenesis and potential therapeutic applications

　　

目的：具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum, F. nucleatum）已被证实与癌症进展和转移的加剧相关。源自革兰氏阴性菌的外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）作为细菌与宿主细胞之间的信息桥梁受到广泛关注。本综述旨在全面探讨F. nucleatum OMVs在疾病发病机制中的作用、其与宿主细胞的相互作用，以及其作为新型治疗靶点或载体工具的潜力。设计：研究人员在PubMed、Scopus和Web of Science中进行了全面的文献检索，检索范围涵盖截至2026年3月发表的研究。随后，依据PRISMA-ScR指南完成本综述。结果：根据预设纳入标准，最终纳入21项研究。这些研究提示，源自F. nucleatum的OMVs含有多种毒力因子蛋白，包括FadA、Fap2和FomA，并与炎症性肠病、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌和类风湿关节炎相关。F. nucleatum OMVs可被肠上皮细胞内化，导致紧密连接蛋白下调。这些囊泡还通过激活自噬、NF-кB信号通路或AIM2炎症小体诱导促炎细胞因子释放。此外，它们促进巨噬细胞向促炎表型极化，最终触发炎症级联反应。进一步研究发现，F. nucleatum OMVs增强细菌黏附和自身聚集，促进免疫抑制，并推动肿瘤生长和转移。值得注意的是，F. nucleatum OMVs还具有作为工程化药物递送载体用于癌症免疫治疗的潜力。结论：本综述总结了关于F. nucleatum OMVs与免疫细胞和非免疫细胞相互作用的分子机制，以及这些OMVs的鉴定和组成方面的现有证据，为其在预防和治疗应用中的潜力提供了见解。

**引言（Introduction）**
具核梭杆菌（F. nucleatum）是一种革兰氏阴性专性厌氧菌，常见于口腔、泌尿生殖道、肠道及上消化道。它通过黏附素（如Aid1、CmpA、Fap2、FomA、FadA和RadD）与宿主细胞结合，并在牙菌斑生物膜中作为初级定植菌与次级定植菌之间的桥梁，促进厌氧微环境的形成。F. nucleatum可被宿主模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别，触发免疫反应并加剧炎症，从而通过调节肿瘤免疫微环境促进肿瘤发生。已知的毒力因子包括FadA、Fap2和FomA等。FadA与E-钙黏蛋白结合激活β-catenin信号，差异调控结直肠癌（colorectal cancer, CRC）细胞的炎症和致癌反应。Fap2通过与Gal-GalNAc结合介导细菌在CRC组织中的富集。FomA是一种主要的外膜孔蛋白，有助于细菌逃避免疫监视。F. nucleatum还能分泌外膜囊泡（OMVs），携带毒力因子发挥致病性。OMVs是20–300 nm的球形双层囊泡，含有磷脂、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、外膜蛋白（outer membrane proteins, OMPs）、周质蛋白、DNA、RNA和肽聚糖等成分。OMVs参与毒力因子运输、营养获取、细胞间通讯和免疫调节，且比母菌含有更高浓度的毒力因子，可通过循环系统远距离递送至靶器官。大量证据表明，F. nucleatum OMVs不仅是重要的毒力介质，还通过长距离传播和宿主免疫调节参与多种炎症性疾病和恶性肿瘤的发病。在牙周炎、炎症性肠病（IBD）、类风湿关节炎（RA）中均观察到其致病作用。此外，OMVs作为治疗平台具有潜力，例如工程化改造后可增强肿瘤靶向性和免疫治疗效果。但目前针对F. nucleatum OMVs的系统性综述仍较少，因此本综述旨在系统总结其分离鉴定、组成特征、致病机制及治疗应用。

**方法（Methods）**
本综述遵循系统综述和荟萃分析扩展范围综述（PRISMA-ScR）指南。在Scopus、Web of Science和PubMed三个数据库中检索截至2026年3月相关文献，检索策略结合布尔运算符，关键词为（'Fusobacterium nucleatum' OR F. nucleatum OR Fn）AND（'outer membrane vesicles' OR OMV OR 'extracellular vesicle' OR EV）。纳入标准包括：以F. nucleatum OMVs为主要研究对象，涵盖体外、体内及临床研究；探讨其生物学特征、作用机制、致病效应或治疗应用；原创同行评审英文文献。排除综述、病例报告、社论、会议摘要等。由两名研究者独立筛选标题和摘要，进行全文评估，分歧由第三方解决。提取资料包括作者、年份、菌株、OMV分离方法、体内外模型、影响的关键分子/通路及主要发现。采用叙事综合法进行定性整合。体外研究偏倚风险评估使用QUIN工具，体内研究使用SYRCLE工具。

**结果（Results）**
文献检索共获得163篇研究，去除重复后筛选90篇，经全文评估后最终纳入21篇。其中多数研究报告了F. nucleatum的完整菌株信息，但6篇未提供；仅1篇未报告OMV分离纯化方法；仅1篇报告了初始细菌剂量和OMV产量。未发现符合纳入标准的临床研究，所有研究均为体外或体内模型。方法学异质性较大，包括OMV剂量、刺激浓度、处理时间及结局指标差异，因此不适合进行定量荟萃分析，采用定性描述综合。偏倚风险评估显示，体外研究整体为中低偏倚风险；体内研究在随机化和盲法方面存在不确定偏倚，但总体偏倚风险较低。

**讨论（Discussion）**
**F. nucleatum OMVs分离与表征**
**F. nucleatum OMVs的分离**
超速离心和微滤是主要分离方法。细菌培养至对数期后，先在6000–10000×g离心30分钟去除菌体，上清经0.22或0.45 μm膜过滤，再经160000–200000×g超速离心2小时沉淀OMVs。部分研究结合超滤或OptiPrep/蔗糖密度梯度离心以提高纯度。密度梯度离心依据分子大小和密度分离囊泡，可增强纯度但步骤繁琐。实际应用中常联合多种方法以获得高纯度且均一的OMVs。

**F. nucleatum OMVs的表征**
透射电子显微镜（TEM）用于观察OMVs形态，显示其为球形双层膜结构，但样品制备复杂且染色可能影响结构。扫描电子显微镜（SEM）可提供三维表面信息。纳米颗粒追踪分析（NTA）检测颗粒尺寸分布和浓度，F. nucleatum OMVs粒径多为40–200 nm，但无法区分细菌碎片。纳米流式细胞术（FCM）检测更快速精密。蛋白质组成分析采用BCA法、SDS-PAGE、Western blot和质谱（MS）技术，其中MS可鉴定数千种蛋白质。

**F. nucleatum OMVs的组成**
OMVs由不对称磷脂双层构成，外层富含LPS，内层主要为磷脂。蛋白质是最丰富的成分。对F. nucleatum subsp. animalis 7_1的研究显示，OMPs占72%，未知定位蛋白占17%，周质蛋白6%，细胞质蛋白5%。另一研究对F. nucleatum ATCC 25586的OMVs分析显示，细胞质蛋白占62.8%，未表征蛋白25.6%，外膜蛋白4.3%，周质蛋白3.7%，差异可能源于亚种和培养条件。FadA、MORN2结构域蛋白和YadA样蛋白等推定毒力因子在OMVs中被检测到。酸性条件可改变OMV蛋白组成，上调T5aSS和MORN结构域蛋白，下调其他蛋白。在酸性OMVs和中性OMVs中均检测到FadA、Fap2、FomA及MORN2结构域蛋白。FomA在OMVs中相对丰度最高，并具有最强促转移能力。

**F. nucleatum OMVs在炎症性疾病中的作用与机制**
**炎症通路激活的级联反应**
F. nucleatum OMVs携带LPS、FomA、肽聚糖等免疫原性分子，可通过Toll样受体（TLRs）激活宿主固有免疫。研究发现，F. nucleatum subsp. polymorphum OMVs通过TLR4激活HT29细胞NF-κB信号，上调IL-8和TNF表达。OMVs可被肠上皮细胞（IECs）内化，上调IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA，下调IL-10及紧密连接蛋白ZO-1和occludin。在实验性结肠炎模型中，OMVs激活自噬（p62下调，LC3II上调），且该过程可被氯喹逆转，机制涉及miR-574-5p/CARD3轴。另有研究显示OMVs通过TLR2和FomA激活NF-κB信号，不依赖TLR4和LPS，且需要动力蛋白和网格蛋白介导。F. nucleatum OMVs还能激活AIM2炎症小体，上调GSDMD和IL-1β，促进细胞焦亡，该效应可被DNase I抑制，表明OMVs中DNA组分是关键。在牙周膜干细胞中，OMVs通过小窝蛋白介导的内吞进入细胞，激活ROS和NLRP3炎症小体，上调炎性因子和基质降解酶，并通过NF-κB损害矿化能力。

**免疫应答调节**
F. nucleatum OMVs可穿过上皮屏障进入黏膜下层，与巨噬细胞等免疫细胞直接相互作用。它们诱导巨噬细胞极化为促炎M1样表型，上调ROS、TNF-α和iNOS，抑制IL-10。在巨噬细胞/Caco-2共培养中，OMVs促进上皮细胞死亡，升高LDH、FADD、RIPK1和cCASP3，诱导坏死性凋亡，破坏屏障。在牙周炎小鼠模型中，OMVs与M1巨噬细胞协同引起牙槽骨丢失和破骨细胞增加。OMVs还能在正常牙周组织中诱导CD11c、CD3和F4/80表达。在类风湿关节炎中，F. nucleatum通过分泌含FadA的OMVs，被巨噬细胞内化，经Rab5a-YB-1轴促进滑膜炎症。此外，OMVs在根尖周炎中诱导巨噬细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡。

**F. nucleatum OMVs在癌症中的作用与机制**
**黏附、进展与转移**
临床CRC组织中富集F. nucleatum OMVs，它们通过膜融合和FomA与FN1441相互作用促进细菌黏附及自身聚集，加重CRC进展。OMVs增强Caco-2迁移能力，但某些植物活性成分可抑制迁移。在乳腺癌中，OMVs激活TLR4通路增强细胞增殖、迁移和侵袭。在口腔鳞状细胞癌（OSCC）异种移植模型中，OMVs诱导上皮-间质转化（EMT），表现为P62和E-cadherin下调，LC3-II、N-Cadherin和Vimentin上调，氯喹可抑制该效应，提示OMVs通过自噬促进肿瘤转移。

**免疫应答调节**
F. nucleatum ATCC 51191的OMVs和LPS可与Siglec-7结合，促进人单核细胞来源树突状细胞（moDCs）的炎症反应。在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中，OMVs所含色氨酸酶诱导巨噬细胞产生吲哚，上调TDO2，经犬尿氨酸激活AHR，形成免疫抑制微环境，抑制CD8⁺ T和CTL浸润，促进Treg浸润。在膀胱癌中，OMVs通过FomA激活TLR2/NF-κB/IL-6轴，诱导巨噬细胞M2b极化，上调VEGF-C促进淋巴转移。黄酮类化合物松属素可抑制这一过程。

**F. nucleatum OMVs的治疗潜力**
OMVs因其天然免疫原性、纳米尺寸和可工程化特性被用于构建药物递送平台。研究者将OMVs包被于金属有机框架（OMV@Fe-ZIF-90@M）负载甲硝唑，靶向三阴性乳腺癌并抑制瘤内F. nucleatum，诱导免疫原性细胞死亡（ICD）和T细胞浸润。另一研究构建FMV@PCFPC纳米颗粒，载入肉桂醛和Fe²⁺，通过铁死亡和ICD增强抗菌和抗肿瘤免疫。F. nucleatum OMVs还可增强溶瘤病毒诱导的PANoptosis，提高GSDMD/E和MLKL表达，与oHSV联合增强抗PD-L1疗效。此外，OMV包被的AgBiS2@ICG纳米球通过PDT/PTT抑制牙周炎细菌，减少骨丢失。然而，OMVs天然含有促炎和潜在致癌成分，需通过蛋白组重塑、内毒素脱毒等工程策略降低毒性。

**结论（Conclusion）**
F. nucleatum OMVs是细菌致病的关键介质，可运输FadA、Fap2、FomA和MORN2结构域蛋白等毒力因子。FomA介导细菌黏附并可保留在CRC细胞表面，有望成为疫苗靶点或诊断标志物。OMVs通过TLR诱导促炎细胞因子，激活炎症反应，并作为纳米颗粒诱导肿瘤免疫抑制微环境，促进癌症进展和转移。工程化OMVs具有抗菌治疗和癌症免疫治疗的转化潜力。

**挑战与未来研究方向（Challenges and future research directions）**
F. nucleatum OMVs的分离纯化过程耗时且所得囊泡存在蛋白质组成和颗粒数的异质性，受亲本菌株、培养条件和分离方法影响。需要标准化OMVs生产、分离和定量方案以提高研究可比性。目前研究多在细胞和动物模型阶段，缺乏临床研究。在临床样本中准确检测和定量F. nucleatum OMVs面临纳米尺寸、异质性和宿主细胞外囊泡干扰等技术障碍。此外，难以区分细菌与其OMVs的特异性标志物。未来需要标准化方法和临床队列研究，并将研究范围从CRC和肠道炎症扩展到其他疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病和不良妊娠结局等，以全面理解OMV介导的宿主-微生物相互作用并推动转化应用。