拓扑异构酶I抑制驱动具有增强Aβ摄取能力的CD74high/MHChigh人小胶质细胞亚型

《Cell Reports》：Topoisomerase I inhibition yields a CD74high/MHChigh human microglial subtype with enhanced Aβ uptake

　　

尽管近年来鉴定小胶质细胞亚型的努力有所加速，但转录组学定义的状态与细胞功能之间的关系在很大程度上仍局限于计算机模拟注释。在此，研究人员表征了两种拓扑异构酶I抑制剂，它们将人小胶质细胞极化为一种以抗原呈递基因表达增加为特征的特殊状态。利用HMC3细胞、iPSC来源的小胶质细胞（iPSC-derived microglia，iMG）和脑类器官（cerebral organoids），研究人员证明喜树碱（Camptothecin）可诱导一种CD74high/MHChigh小胶质细胞样亚型，该亚型专门从事淀粉样β（amyloid beta，Aβ）吞噬，并在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激下减少白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的分泌。此外，喜树碱在斑马鱼淀粉样蛋白病模型中抑制淀粉样毒性并将小胶质细胞恢复至其稳态形态。研究人员还鉴定出托泊替康（Topotecan），一种美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的喜树碱类似物，作为CD74high/MHChigh特征的驱动因子。该报告提供了一种可重复的方法，在体外重现人小胶质细胞状态，从而实现其功能表征，并为体内合理调节人小胶质细胞奠定基础。

一、研究背景与科学问题

小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中维持稳态的关键免疫细胞，承担突触修剪、病原体清除、代谢废物处理等多种重要功能。过去十年间，随着单细胞（single-cell，sc）RNA测序技术的进步，多个研究团队相继发表了表征人小胶质细胞异质性的数据集，极大改变了人们对人小胶质细胞多样性的理解。然而，尽管目前已有多个数据集提出了不同的人小胶质细胞群体结构，转录组学定义的小胶质细胞亚型与细胞实际功能之间的联系仍主要停留在计算机模拟注释层面，缺乏直接的实验验证。这一瓶颈严重制约了人们对小胶质细胞在稳态维持及神经退行性疾病发生发展中作用的理解，也阻碍了针对特定小胶质细胞亚型的治疗策略开发。

研究人员此前基于215,680个来自74名供体、涵盖多种神经系统疾病和CNS区域的人活体小胶质细胞单细胞转录组数据，建立了跨疾病人小胶质细胞图谱，定义了12种小胶质细胞亚型，并通过计算机模拟筛选鉴定出3种候选化合物，可在体外人小胶质细胞3（Human Microglial Cell 3，HMC3）细胞系中模拟特定小胶质细胞亚型的转录特征。本研究在此基础上，对喜树碱（Camptothecin）这一先导化合物进行深入功能表征，旨在建立转录组学定义的小胶质细胞亚型与细胞功能之间的直接联系。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用多种互补模型系统——包括HMC3小胶质细胞样细胞系、iPSC来源的小胶质细胞样细胞（iMG）以及含整合iMG的脑类器官（CO-iMG）——系统验证了喜树碱及其FDA批准的类似物托泊替康（Topotecan）作为CD74^high/MHC^high小胶质细胞亚型转录程序强效驱动因子的作用。该亚型以MHC I类和II类基因以及CD74（MHC II类不变链和迁移抑制因子受体）高表达为特征。两种拓扑异构酶I抑制剂同时抑制了富含阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和多发性硬化（multiple sclerosis，MS）易感基因的SRGAP2^high/MEF2A^high疾病富集小胶质细胞（Disease Enriched Microglia，DEM）亚型转录程序。功能实验揭示CD74^high/MHC^high小胶质细胞呈现底物特异性摄取表型：葡聚糖内吞和E. coli吞噬活性降低，而单体Aβ摄取显著增强。在TNF-α刺激下，该亚型IL-6、IL-8和MCP-1分泌显著减少。代谢分析显示喜树碱诱导低代谢状态，总ATP产生率较DMSO对照降低49%。在斑马鱼淀粉样蛋白病模型中，喜树碱剂量依赖性地减少I型活化小胶质细胞数量，高剂量（1 μM）可显著恢复Aβ_1-42注射导致的突触密度下降。

三、关键技术方法

本研究采用多层次的实验策略。首先基于大规模人小胶质细胞单细胞转录组数据进行计算机模拟药物筛选，通过RT-qPCR进行化合物验证（第一阶段），随后在多种体外模型系统中进行深入验证（第二阶段）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合细胞哈希抗体（cell hashing antibodies）标记技术用于表征化合物处理后的转录状态，MELD算法用于量化单细胞水平的处理相关可能性。功能表征方面，利用pHrodo标记的不同底物（葡聚糖、Aβ_1-42、E. coli）通过流式细胞术和活细胞成像系统评估内吞和吞噬能力；利用15重细胞因子检测阵列评估促炎细胞因子分泌；利用Seahorse MitoStress测试评估线粒体功能；利用MitoCarta3.0数据库进行线粒体表型（mitotype）分析。体内验证采用Tg(mpeg1:EGFP)转基因斑马鱼淀粉样蛋白病模型，通过免疫组化和共聚焦成像评估小胶质细胞形态和突触密度。样本队列来源包括74名供体的人小胶质细胞、HMC3细胞系（ATCC CRL-3304）、FA0000010、WTC11和MSN38 iPSC系。

四、研究结果

（1）HMC3小胶质细胞样细胞中CD74^high/MHC^high转录特征的药理学激活

研究人员对喜树碱（1 μM）处理24小时的HMC3细胞进行scRNA-seq分析（未处理n=4729细胞；DMSO n=3434细胞；喜树碱n=2790细胞）。UMAP显示喜树碱将HMC3细胞极化为独特的转录空间。模块评分分析显示，喜树碱处理后CD74^high/MHC^high特征显著升高（p ≤ 5E?324），而SRGAP2^high/MEF2A^high DEM特征显著降低（p = 2.81E?279）。进一步验证表明，喜树碱同样诱导了其他四项独立研究定义的MHC^high人小胶质细胞特征，证明结果对不同基因集组成具有稳健性。

（2）化合物处理的iMG和CO-iMG证实喜树碱是CD74^high/MHC^high特征的强效诱导因子

在iMG（第28-29天分化）中，喜树碱（0.1 μM）和托泊替康（0.1 μM）处理24小时后进行scRNA-seq。MELD分析显示，处理相关可能性高的细胞群中CD74^high/MHC^high模块评分显著升高（低vs高可能性组p ≤ 0.0001，r = ?0.551）。在CO-iMG模型中（n=261 CO-iMG细胞），两种剂量的喜树碱（0.1 μM和0.5 μM）均在高可能性细胞群中显示显著更高的CD74^high/MHC^high特征。跨四个单细胞数据集的效应量合并分析显示效应显著为正（n=4，t=2.71，p=0.037），证明结果具有一致性。

（3）功能表征：内吞和吞噬特性

在HMC3细胞中，喜树碱预处理导致葡聚糖内吞活性降低（DMSO vs喜树碱p=0.0057）和E. coli吞噬下调（p=0.0141），而单体Aβ摄取显著上调（p=0.0142）。在iMG中（n=4-5次独立分化），使用pHrodo偶联Aβ_1-42进行16小时纵向吞噬实验，随机效应荟萃分析显示，10小时时0.05 μM（n=4，p=0.0075）和0.1 μM（n=5，p=0.0014）喜树碱均显著增加Aβ吞噬。RFP平均强度分析进一步证实喜树碱增加了每个iMG细胞的Aβ_1-42吞噬量。

（4）功能表征：促炎趋化因子和细胞因子分泌

在TNF-α刺激下，喜树碱预处理的HMC3细胞在12小时和24小时均显著降低IL-6、IL-8和MCP-1分泌。托泊替康完全重现了喜树碱观察到的细胞因子释放模式，功能上验证了拓扑异构酶I抑制诱导的功能独特状态。

（5）功能表征：线粒体表型

Seahorse MitoStress测试显示，喜树碱（1 μM）处理24小时后，HMC3细胞总ATP产生率较DMSO对照降低49%（p=0.0001），糖酵解和氧化磷酸化来源的ATP产生率均降低，提示诱导低代谢状态。在iMG中，线性回归分析显示喜树碱剂量增加导致基础总ATP水平降低（p=0.004，R²=0.717）。

（6）人小胶质细胞亚型富集特定线粒体表型

利用MitoCarta3.0的149条线粒体通路进行基因集富集分析（GSEA），CD74^high/MHC^high亚型（簇8/10）富集脂质代谢、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽代谢以及金属和辅因子相关通路。在喜树碱处理的HMC3、iMG和CO-iMG中均重现了这些发现，显示氧化磷酸化和铁稳态线粒体表型富集。

（7）喜树碱剂量依赖性地恢复斑马鱼突触密度并调节小胶质细胞活化

在斑马鱼淀粉样蛋白病模型中，Aβ_1-42注射导致I型（活化-圆形）小胶质细胞显著增加（p < 0.0001）。喜树碱处理剂量依赖性地减少I型小胶质细胞数量（0.1 μM：p < 0.0001；1 μM：p < 0.0001）。SV2突触标记分析显示，Aβ_1-42注射显著降低SV2信号（p < 0.0001），高剂量喜树碱（1 μM）可显著恢复SV2水平（p < 0.01），而低剂量无显著效果。

五、讨论与结论

本研究建立了从转录组学定义的小胶质细胞亚型到可经验测量的细胞功能的直接联系，填补了小胶质细胞亚型功能表征的关键空白。CD74^high/MHC^high亚型对Aβ吞噬的增强作用尤为值得关注，因为该亚型同时抑制富含AD、MS和帕金森病易感基因的DEM亚型特征。托泊替康作为FDA批准的药物，在临床上比喜树碱更有效且更安全，可能代表小胶质细胞靶向AD治疗开发的切入点。其作用机制与现有抗淀粉样抗体不同，可能增强现有治疗的效果，或为抗体治疗无应答或出现不良事件的患者提供替代选择。研究人员指出，AD治疗的目标可能涉及特定小胶质细胞亚型频率的微妙转变而非小胶质细胞的整体消除，新一代喜树碱类似物的开发可能为此提供更大潜力。研究局限性包括HMC3永生化细胞系的固有局限、pHrodo荧光无法区分吞噬摄取增加与溶酶体降解减少，以及细胞因子分泌数据未按细胞数归一化。未来研究需进一步阐明这些小胶质细胞亚型的功能、时间动态和疾病关联，再考虑将其作为潜在治疗靶点。