《Diagnostics》：Laboratory-Developed NGS Panel for Characterization of Advanced Colorectal Cancer, Real-World Data from a Tertiary Referral Centre
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背景/目的：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。其发生发展由遗传和表观遗传改变的复杂相互作用驱动，导致显著的生物学异质性和不同的临床结局。因此，全面的分子谱分析对于准确表征CRC和指导个体
背景/目的：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球最常见恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因。其发生发展由遗传和表观遗传改变的复杂相互作用驱动，导致显著的生物学异质性和不同的临床结局。因此，全面的分子谱分析对于准确表征CRC和指导个体化治疗策略至关重要。在此背景下，下一代测序（next-generation sequencing，NGS）已成为一种强大工具，能够在单次检测中实现多个临床相关基因组改变的高通量同步检测。方法：研究人员报告了使用实验室自研NGS Panel对晚期CRC进行常规评估的经验。共611例结直肠癌标本通过覆盖25个癌基因和抑癌基因的229个扩增子的实验室自研多基因NGS Panel进行分析。结果：该Panel展现出分析可行性，仅1.3%的样本因DNA质量/数量低下导致检测失败。RAS基因（KRAS和NRAS，分别在51.2%和2.7%的病例中发生改变），以及BRAF（10.6%）、PIK3CA（16.1%）、SMAD4（11.8%）和TP53（64.3%）是研究队列中最常发生改变的分子标志物。CRC主要可操作基因改变的频率在原发灶（n = 482）和转移灶（n = 121）之间具有可比性，提示两组间突变频率相似。结论：本研究展示了一种专为CRC常规临床实践中分子谱分析而设计的实验室自研多基因NGS Panel。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率排名第三的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。受全球人口增长、人口老龄化和社会经济发展等因素影响，CRC总体疾病负担预计将显著上升，预计到2030年将新增220万病例和110万癌症相关死亡，到2040年新增诊断将达320万。CRC的发病率在高收入地区最高，中低收入国家亦呈持续增长趋势，同时早发型CRC的发病率也在不断上升。
CRC是一种生物学高度异质性的疾病，由反复出现的体细胞改变驱动，这些改变塑造肿瘤行为、影响治疗反应并影响预后。大规模基因组研究，包括癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）计划，已确立KRAS是CRC中最常发生突变的癌基因，约35%–50%的病例存在突变，其中多数聚集在外显子2的12和13密码子，已知可导致抗EGFR治疗耐药并与转移性疾病的较差预后相关。NRAS突变较少见，约见于4%–9%的CRC，与KRAS改变类似，同样预示EGFR抑制剂治疗无效。BRAF突变（最常见为p.Val600Glu）见于约4%–15%的患者，定义了一个以侵袭性临床病程、较差总生存期和常伴微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）为特征的独特分子亚群。PIK3CA改变存在于10%–25%的肿瘤中，通常影响外显子9和20，与PI3K/AKT信号通路调控、治疗反应潜在影响及RAS通路突变相互作用有关。SMAD4突变涉及TGF-β信号通路，见于较小亚群（约5%–15%），常与更晚期疾病和转移进展相关。TP53和APC等结构和信号基因以更高频率发生突变，是结直肠肿瘤发生中的关键事件，但在当前多数治疗算法中不属于核心可操作基因集。
目前CRC的常规分子诊断要求检测错配修复（mismatch repair，MMR）蛋白表达和微卫星不稳定性（MSI）状态，以及KRAS、NRAS和BRAF单核苷酸点突变。MMR/MSI评估对识别DNA修复缺陷患者至关重要，这不仅具有预后意义，还可预测免疫治疗反应。KRAS、NRAS和BRAF突变分析为靶向治疗选择提供依据，尤其是抗EGFR药物，并有助于指导个体化系统治疗策略。然而，随着越来越多分子被确定为潜在治疗靶点或耐药介导因子，依赖传统单基因检测正变得越来越具有挑战性，这凸显了需要能够同时评估多个临床相关基因的综合分子谱分析方法。
下一代测序（NGS）技术的出现彻底改变了这一格局，能够在单次检测中以高灵敏度和特异性对多个基因组改变进行同步高通量分析。与基于PCR的单基因检测不同，NGS可检测广泛的基因组事件，包括单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）、插入/缺失（indels）、拷贝数改变和融合，同时最大限度减少组织消耗。在此背景下，整合已确立生物标志物和新兴靶点的实验室自研NGS Panel代表了一种资源高效且具有临床信息价值的策略，可提高预后判断准确性、阐明治疗耐药机制并扩大患者参与基因型驱动临床方案的资格。
本研究评估了实验室自研、院内扩增子热点DNA NGS Panel在大型结直肠癌标本队列中的真实世界分析应用，该Panel设计用于检测SNVs和小片段indels。研究重点关注该Panel在常规诊断工作流程中的技术性能、可行性和稳健性，以及所分析队列中识别的突变谱特征。
研究人员共对611例CRC病例进行了检测，这些病例来自意大利博洛尼亚S. Orsola综合医院IRCCS分子病理实验室2023年1月至2025年11月期间的常规诊断活动。所有标本均取自福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed, paraffin-embedded，FFPE）组织块。DNA提取自2至3张10 μm厚切片，由病理医师根据最近的血红素-伊红（H&E）染色切片进行选择，要求肿瘤细胞百分比不低于10%。使用Qubit荧光计测量DNA浓度。所有实验程序均符合意大利数据保护机构关于科研目的处理个人数据的一般授权，所有人类材料信息均使用匿名数字代码管理，所有样本均按照《赫尔辛基宣言》处理。研究未影响所涉及患者样本的临床管理。
NGS分析使用该实验室自研的定制多基因Panel进行，该Panel可评估25个基因的SNVs和indels，涵盖229个扩增子（15.04 kb，人类参考基因组hg19/GRCh37）。当前Panel配置基于先前验证的22基因检测体系，并进行了修改以扩展和完善临床实践中评估的分子靶标。分析基因和区域包括BRAF（外显子11和15）、CTNNB1（外显子3）、EGFR（外显子12、18–21）、EIF1AX（外显子1和2）、GNA11（外显子4和5）、GNAQ（外显子4和5）、GNAS（外显子8和9）、H3F3A（外显子1）、HRAS（外显子2和3）、IDH1和IDH2（外显子4）、KIT（外显子8、9、11、13和17）、KRAS（外显子2–4）、MED12（外显子1和2）、MET（外显子2和14）、MYC（外显子1–3）、NRAS（外显子2–4）、PDGFRA（外显子12、14和18）、PIK3CA（外显子10和21）、PTEN（外显子5）、RET（外显子5、8、10、11、13、15和16）、RNF43（外显子2和8）、SMAD4（外显子6和9–12）、TERT（启动子区域）和TP53（外显子4–9）。APC和FBXW7未纳入Panel，因为其突变广泛分布于编码区，不限于少数重复热点区域。
测序在GeneStudio S5 Prime平台上进行，每个样本约30 ng DNA用于构建扩增子文库，使用Ion Chef系统进行模板制备，随后在Ion 530芯片上测序。序列数据使用Ion Reporter软件处理，变异过滤的等位基因频率阈值范围为0.05至1.0。所有过滤后的变异均由两名独立评审员进行人工审查，仅双链均检出且占总读数至少5%的变异纳入突变分析。该检测常规实现≥95%的覆盖均匀性和≥98%的靶向率，分析灵敏度/检测限为5%。变异致病性使用Varsome平台确定，良性或可能良性变异被排除分析。为与公开数据比较，从cBioPortal检索了TCGA PanCancer Atlas 2018结直肠腺癌队列的突变频率。原发灶和转移灶之间突变频率差异使用Fisher精确检验评估，p值采用Benjamini–Hochberg错误发现率（false discovery rate，FDR）程序进行多重比较校正，p < 0.05为差异有统计学意义。
在611例经NGS分析的样本中，8例（1.3%）因DNA质量或数量低下被排除，后续分析在剩余603例可评估标本中进行。603例标本中仅44例（7.3%）在所分析基因中未检出任何改变。在其余559例标本中，共在23个基因中检出1019个致病性、可能致病性或意义未明变异（pathogenic/likely pathogenic/variants of uncertain significance，P/LP/VUS）。RAS基因（KRAS、NRAS和HRAS）以及BRAF、PIK3CA、SMAD4和TP53是研究队列中最常发生改变的分子标志物。
KRAS、NRAS和HRAS：KRAS突变在603例标本中的309例（51.2%）中检出。多数变异位于外显子2（273/309突变病例，88.6%），外显子3（17/309，5.5%）和外显子4（19/309，6.1%）的改变较少。最常见的突变为p.Gly12Asp（86/309突变病例，27.8%），其次为p.Gly12Val（75/309，24.2%）、p.Gly13Asp（41/309，13.3%）、p.Gly12Cys（22/309，7.1%）和p.Gly12Ala（21/309，6.9%）。除p.Asp108Asn被根据ACMG标准判定为VUS外，所有变异均分类为致病性或可能致病性。NRAS基因在603例标本中的16例（2.7%）中发生突变。多数变异位于外显子3（11/16，68.8%），其次为外显子2（5/16，31.2%）。最常见的突变为p.Gln61Lys（5/16，31.3%），其次为p.Gln61Leu（3/16，18.8%）和p.Gly13Arg（3/16，18.8%）。所有变异均分类为致病性。HRAS突变在603例标本中的8例（1.3%）中检出，变异位于外显子2、3和4，根据ACMG标准分类为致病性或VUS。
BRAF：BRAF突变在603例标本中的64例（10.6%）中检出。BRAF p.Val600Glu是最常见变异（50/64，78.1%），其次为p.Asp594Gly（4/64，6.3%）、p.Asp594Asn（3/64，4.7%）和其他罕见BRAF变异（总计7/64，10.9%）。几乎所有变异均位于外显子15，仅p.Gly469Arg（n = 1）定位在外显子11。所有变异均分类为致病性。
非RAS/BRAF突变：在非RAS/BRAF突变中，最常见的改变涉及以下基因：PIK3CA（97/603，16.1%）、SMAD4（71/603，11.8%）和TP53（388/603，64.3%）。多数PIK3CA和SMAD4变异分类为致病性或可能致病性，仅少数分类为VUS。TP53突变跨越外显子4–9，几乎所有均分类为致病性。其他较少见的突变在多个基因中检出，包括GNAS（2.5%）、IDH1（1.7%）、PTEN（1.3%）、RET（1.3%）、CTNNB1（1.2%）、KIT（0.8%）、MET（0.8%）、MYC（0.8%）、MED12（0.7%）、GNAQ（0.3%）和PDGFRA（0.2%）。
原发灶和转移灶：研究人员分析了原发灶（n = 482）和转移灶（n = 121）非配对标本中主要遗传改变的分布。总体而言，两组突变谱大致可比，原发灶中改变的患病率略高于转移灶标本，但差异无统计学意义。KRAS是两组中最常发生改变的基因，原发肿瘤（253/482，52.5%）和转移样本（56/121，46.3%）中的突变率相似（FDR校正p值 = 0.393）。PIK3CA、SMAD4和BRAF突变以可比频率检出，但转移灶中观察到轻度降低。相比之下，NRAS和HRAS改变在两组中均不常见，在转移标本中尤其罕见。总体而言，这些发现表明所评估的主要驱动基因改变的频率在原发灶和转移灶组之间大致相似。然而，鉴于样本的非配对性质以及靶向热点测序的局限性，这些发现不应被解释为原发灶和转移灶肿瘤完全基因组等同的证据。尽管如此，这些结果支持在转移灶材料不可用或不充分时，使用原发肿瘤组织进行Panel所评估的主要驱动基因改变的分析。
讨论部分指出，目前CRC突变谱的全面表征对于指导精准肿瘤学方法至关重要。RAS野生型肿瘤可能从抗EGFR单克隆抗体中获得临床获益，而RAS突变型CRC对这些药物具有内在耐药性。BRAF p.Val600Glu突变型CRC代表预后不良的独特分子亚组，但可从BRAF和EGFR联合抑制中获益，如BEACON CRC试验所证实。此外，微卫星高度不稳定（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）的肿瘤对免疫检查点抑制剂（包括pembrolizumab和nivolumab）表现出显著敏感性，这些药物已成为该情况下的标准治疗。另一个可操作亚组包括HER2扩增、RAS/BRAF野生型CRC，抗HER2策略已显示出临床意义的活性。最后，尽管罕见，NTRK基因融合可用组织不可知TRK抑制剂靶向治疗。相反，PIK3CA、TP53和SMAD4的频繁改变目前缺乏获批的CRC靶向治疗，主要具有预后或生物学意义。
目前ESMO指南推荐对所有转移性CRC患者在诊断时检测MMR状态和KRAS、NRAS和BRAF突变。在CRC中，所有ESCAT I级基因组改变均为点突变，ESMO支持使用NGS作为PCR方法的替代方案。
研究人员报告的实验室自研定制多基因NGS Panel与单基因方法相比具有多项优势，包括高通量多重分析、可同时分析多个基因并检测更广泛的基因组改变。与先前研究相比，本研究纳入的队列规模显著更大，提供了更全面的CRC分子改变表征。该Panel被专门设计为聚焦热点Panel，以解决CRC常规诊断中最相关的分子改变，减少靶标内容有助于工作流程可扩展性、数据分析和成本控制，同时保持预期临床应用所需的分析性能。
研究队列中检出了GNAS、IDH1、PTEN、CTNNB1、KIT、MET、RET和GNAQ等基因的罕见突变，这些罕见突变（多数根据ACMG标准为致病性或可能致病性）存在于13.2%的分析病例中，凸显了广泛多基因检测在识别常见驱动突变之外潜在相关基因组事件的价值。
本研究还证明，最常见的可操作基因在原发灶和转移灶CRC病变中以几乎相同的频率检出。尽管比较基于非配对队列，反映的是群体水平的一致性而非患者特异性基因组一致性，但研究结果支持在转移灶组织不可用时使用原发肿瘤组织进行主要临床可操作驱动基因的常规分子分析。然而，原发灶和转移灶不应被视为完全可互换，因为瘤内异质性、克隆进化和治疗产生的耐药突变可能导致转移部位出现额外改变。
该定制NGS Panel被证明可靠且稳健，仅1.3%的测试样本未能产生可评估结果。该Panel还能在单次测序运行中同时分析多种癌症类型，包括甲状腺结节、黑色素瘤、胰腺病变、肝细胞癌、颅咽管瘤、胶质瘤和胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）。通过将常规CRC标本与其他肿瘤类型样本混合，该工作流程允许每次运行分析多达32–40个标本，平均周转时间为7.4个工作日，试剂成本为每样本400至450欧元。与连续单基因检测相比，多重方法可在单次测序运行中同时分析25个基因，所需DNA输入量有限，并减少了实验室工作流程中的操作时间和耗材使用。
研究人员澄清，本研究的主要目标是评估实验室自研多基因NGS Panel的应用和常规临床实施，而非评估其与临床结局的关联，因此治疗反应、无进展生存期、总生存期或治疗特异性预测价值的分析不在本研究范围内。
研究局限性包括：该Panel专门设计用于临床相关驱动基因的热点突变分析，不检测CRC中其他临床相关生物标志物如MMR/MSI状态、HER2扩增或NTRK基因融合；本研究为单中心回顾性研究，缺乏独立外部验证队列可能限制结果的普适性；未根据TNM分期、肿瘤分化等级和MMR/MSI状态进行分层亚组分析。
结论：本研究提示实验室自研多基因NGS Panel是CRC常规分子谱分析的可靠工具，可能支持精准医学在临床实践中的实施。研究数据表明，靶向、资源高效的多基因方法可以在不增加周转时间或成本的情况下，提供超越标准单基因检测的临床可操作信息。关键预测生物标志物的同步评估可实现更全面的患者分子分层，从而支持个体化治疗决策。
