基于近红外荧光免疫层析的定量POCT-FIT在人群结直肠癌筛查中的应用：与集中式检测系统的比较评估

《Diagnostics》：Application of a Quantitative POCT-FIT Based on Near-Infrared Fluorescence Immunochromatography in Population-Based Colorectal Cancer Screening: A Comparative Evaluation with a Centralized Testing System

　　

背景/目的：粪便潜血检测（FOBT）是结直肠癌（CRC）筛查的基石。然而，目前的定量FOBT依赖于集中式检测系统，这限制了其在社区健康初步筛查中的可及性。本研究旨在建立一种基于近红外荧光免疫层析的快速、高灵敏度定量粪便潜血检测方法（以下简称即时检测粪便免疫化学检测，POCT-FIT），并在人群CRC筛查中将其性能与集中式检测系统进行比较评估。方法：研究人员采用抗人血红蛋白单克隆抗体标记近红外荧光纳米球（激发波长770 nm；发射波长794 nm），并通过免疫层析技术制备粪便潜血检测试纸条。使用荧光免疫层析分析仪扫描检测线（T）和质控线（C）的荧光强度。计算不同血红蛋白浓度下T线荧光强度与C线荧光强度之比（T/C），并在50至2000 ng/mL范围内生成标准曲线。研究人员共收集115份临床粪便样本，与商用OC-Sensor系统（Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan）进行方法学比较。在温州社区健康实施的一项非配对CRC筛查项目中，3163名参与者被分配到集中式检测组（OC-Sensor系统），5211名参与者被分配到POCT-FIT组（近红外荧光免疫层析方法）。阳性阈值设定为100 ng/mL。结肠镜检查和组织病理学结果作为金标准。结果：对115份样本的检测结果显示，两种方法之间存在强线性相关性（R = 0.9959）和良好的一致性。在社区健康筛查中，集中式检测组（OC-Sensor）的CRC患病率为2.78%（88/3163），分布式检测组（POCT-FIT）为1.00%（52/5211）。两组的CRC灵敏度分别为98.9%（95% CI: 95.8–99.9%）和100%（95% CI: 93.2–100%），差异无统计学意义；特异度分别为29.2%（95% CI: 27.6–30.8%）和27.3%（95% CI: 26.1–28.5%），集中式检测组略高（p = 0.001）。两种方法的阳性似然比和阴性似然比相当。结论：POCT-FIT方法的灵敏度与OC-Sensor方法相当，其阴性结果与较低的CRC漏诊概率相关，这可能有助于降低CRC治疗的医疗保险支出。POCT-FIT操作简便、便携，一次性免疫层析试纸条的价格远低于浊度法（集中式检测系统）。因此，它满足了低日检测量场景（如社区健康初筛或资源有限和人口稀少地区）的实际需求，并可作为集中式检测的有效补充。

基于近红外荧光免疫层析的定量POCT-FIT在人群结直肠癌筛查中的应用：与集中式检测系统的比较评估

一、研究背景与目的

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，2020年新发病例约193万例，死亡病例约93万例。粪便潜血检测（fecal occult blood testing, FOBT）因其无创、简便、低成本和高接受度，被指南推荐为CRC初筛方法。大规模前瞻性队列研究证实，两次及以上FOBT筛查可使CRC死亡率降低44%，粪便血红蛋白浓度是未来CRC检出最强的预测因子之一（校正OR = 9.4），这进一步强化了FOBT在CRC筛查中的核心地位。

传统定性FOBT方法（如胶体金免疫层析或愈创木脂法）虽便捷，但存在结果判读主观性强、人群筛查中假阳性率高等明显局限。Cochrane系统综述（2022年发表）明确显示，定量粪便免疫化学检测（fecal immunochemical testing, FIT）在CRC诊断准确性方面显著优于传统定性方法。中国近期一项多中心诊断试验（2618例门诊患者）表明，20 ng/mL截断值下的定量FIT对CRC的灵敏度达100%，而三种定性FIT方法仅达66.7%–83.3%。浙江省海宁市2021–2023年的大规模筛查研究也证实，定量FIT在筛查性能和单位成本方面均优于定性FIT。

目前国际上应用最广泛的定量FIT系统是OC-Sensor平台（Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan），其采用乳胶凝集免疫比浊法，性能良好。然而，该平台需要昂贵的自动化分析仪、经培训的专业操作人员、集中式实验室以及从各社区健康中心采集粪便样本的冷链运输。高额的仪器成本和单次检测费用严重限制了其在社区健康和资源有限环境中的部署。因此，开发一种简便、经济且可现场操作的（“分布式”）定量FOBT技术（即时检测，point-of-care testing, POCT）对于扩大CRC筛查迫在眉睫。

近红外荧光免疫层析技术具有高灵敏度（发射光能量较低，可避免生物大分子的自发荧光）和超稳定性（无淬灭现象）等优点，在定量POCT应用中显示出良好前景。本研究旨在建立一种基于该技术的新型快速、高灵敏度定量粪便潜血检测方法，并通过临床样本比较和温州社区健康筛查系统评价其性能，为CRC初筛提供实用的分布式POCT-FIT方案。

二、研究设计与方法

本研究采用非配对设计，在2024–2025年温州高风险人群（50–74岁）CRC筛查项目中收集FIT结果及相应的结肠镜和病理结果。所有参与者均接受FIT和CRC风险评估问卷。FIT阳性（检测值≥100 ng/mL）或问卷评估为高风险者被推荐接受结肠镜检查。结肠镜检查由经验丰富的内镜医师在参研医院进行，可疑病变均行活检并送病理检查。病理诊断由两名病理医师独立判读，意见不一致时由资深病理医师仲裁，最终共识作为金标准。

三、主要关键技术方法

1. 近红外荧光免疫层析平台：包括WZBIOG-2022荧光免疫层析分析仪及配套FOB检测试纸条，由研究团队开发并委托温州百欧急科技有限公司按技术规范生产。试纸条由样品垫、预载近红外荧光标记抗人血红蛋白抗体的玻璃纤维结合垫、包被检测线（T线）和质控线（C线）的硝酸纤维素膜、吸水垫和背衬卡组成。

2. 抗体标记与试纸条制备：采用EDC活化羧基化近红外荧光纳米球（激发770 nm/发射794 nm），与FOB标记抗体偶联形成酰胺键；包被抗体（1 mg/mL）和羊抗鼠IgG多克隆抗体（0.5 mg/mL）喷涂于硝酸纤维素膜上形成T线和C线。

3. 标准曲线建立：将FOB参考标准品梯度稀释至50–2000 ng/mL，检测各浓度下T/C比值，采用四参数logistic拟合生成工作曲线（参数：a = 6.674，d = ?0.1286，b = ?0.8179，c = 2092，R ≈ 1.0），通过二维码导入分析仪。

4. 临床样本比较：收集115份临床粪便样本，每份分为两份，分别用OC-Sensor稀释液和自制稀释液处理后，采用两种方法平行检测，计算线性相关系数并进行Bland–Altman一致性分析。

5. 统计分析：使用SPSS 26.0计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比。阳性阈值经ROC曲线分析确定（AUC = 0.825，95% CI: 0.773–0.877，p < 0.001），100 ng/mL处灵敏度100%，Youden指数0.279。

四、研究结果

3.1 近红外荧光检测
近红外荧光纳米球具有活化羧基（?COOH），可与标记抗体的氨基（?NH2）缩合形成酰胺键，激发和发射波长分别为770 nm和794 nm。标记复合物可在干燥状态下稳定储存。

3.2 免疫层析试纸条
试纸条由背衬卡、吸水纸、硝酸纤维素膜、荧光垫和样品垫组成。样本经样品垫毛细作用迁移至荧光垫，荧光标记抗体与靶标结合形成复合物，被T线固定抗体捕获形成“捕获抗体–靶标–荧光标记”复合物；过量荧光标记物则被C线的羊抗鼠IgG捕获。荧光分析仪采用共聚焦机制：770 nm激发光经分束器反射聚焦至样本，发射的794 nm荧光经同一透镜收集、滤波后被检测器接收。步进电机驱动样品台扫描，获得包含T线和C线两个脉冲的荧光强度图谱。

3.3 标准曲线
T/C比值法避免了检测环境干扰，无需校准。在50–2000 ng/mL范围内，四参数logistic拟合显示实验数据与曲线拟合度极佳。

3.4 临床样本比较结果
115份临床粪便样本经两种方法平行检测，结果显示两者R = 0.9959，Bland–Altman分析一致性好，表明新建立的POCT-FIT方法与商用OC-Sensor系统在定量结果上具有高度一致性。

3.5 阳性阈值与社区筛查

3.5.1 阳性阈值的确定
基于社区健康中心的大规模筛查数据，经ROC曲线分析，AUC = 0.825。在100 ng/mL阈值处，灵敏度为100%，Youden指数0.279；若阈值提高至500 ng/mL，特异度虽可提升至77.1%，但灵敏度将降至76.9%。考虑到灵敏度在初筛质量评价中起主导作用，选择100 ng/mL作为阳性阈值。

3.5.2 结肠镜验证与检出率
OC-Sensor组有6158例FIT阳性者，3163例接受结肠镜检查（依从率51.4%），确诊88例CRC（检出率2.78%）；POCT-FIT组有9833例FIT阳性者，5211例接受结肠镜检查（依从率53.0%），确诊52例CRC（检出率1.00%）。检出率差异提示两组人群基线风险不同。

3.5.3 筛查性能比较
灵敏度：两组差异无统计学意义，POCT-FIT组达到100%灵敏度，两种方法均能有效识别CRC。
特异度：集中式检测组高于POCT-FIT组（p ≤ 0.001）。
似然比：两种方法的阳性似然比和阴性似然比相当，表明两者在确认或排除CRC方面无实质差异。
阳性预测值（PPV）：集中式检测组高于POCT-FIT组，但受患病率影响，不可直接进行组间比较。

五、讨论

本研究采用的非配对设计导致两组人群的基线特征和CRC患病率存在差异。虽然核心指标（灵敏度、特异度、似然比和Youden指数）一般被认为与患病率无关，但这种数学独立性依赖于检测方法的操作特征在不同人群中保持恒定的假设。本研究中两种方法采用相同阳性阈值和一致结肠镜确认标准，因此核心指标的组间比较仍然有效。但未来应在同一人群中进行配对或随机设计，以完全消除人群差异的混杂效应。

此外，筛查设计仅对FIT阳性或问卷高风险者进行结肠镜检查，引入了部分验证偏倚。由于两种方法在同一筛查框架下评估，偏倚方向和幅度相似，因此组间比较的有效性较强。本研究未对年龄、性别、家族史和地理区域等潜在混杂因素进行分层调整，未来分析可进一步探讨这些因素对不同检测方法性能的影响。

集中式检测系统特异度约高出2%（29.2% vs. 27.3%），差异具有统计学意义。这主要归因于检测模式：中心实验室在标准化环境控制、专业操作流程和严格质量控制体系下运行，有助于减少现场操作变异和试剂储存条件波动等因素导致的假阳性结果。本研究中，POCT-FIT和OC-Sensor的特异度分别为27.3%和29.2%，意味着约70%的筛查阳性者实际并未患CRC。但在浙江省，结肠镜检查仅约400元人民币，而CRC中位治疗费用通常达30万元人民币，因此从整体角度看，假阳性筛查所致的费用可能远低于假阴性所致医疗费用和生命损失。

从总体诊断性能看，两种方法的Youden指数分别为0.281和0.273，两者仅相差0.008，表明POCT-FIT在总体诊断性能上与集中式系统无实质差异，分布式检测不会牺牲诊断准确性。CRC筛查的核心价值在于灵敏度接近100%且LR?接近0，两种方法在此关键指标上表现一致，阴性结果在两种模式下均具有良好的排除价值。LR+约1.39反映了FOB固有的局限性。

六、结论

分布式（POCT-FIT）和集中式（OC-Sensor）定量FIT方法在检测CRC方面具有相当的灵敏度，均达到高水平，且阴性结果与较低的CRC漏诊概率相关。Youden指数分析表明两种方法的总体诊断准确性可能相似。POCT-FIT采用“实时采样、及时检测”模式，确保样本新鲜度的同时降低了检测成本和周转时间，满足了低日检测量场景的实际需求，是集中式检测的有效补充。本研究为分布式定量粪便免疫化学检测在CRC筛查中的有效应用提供了初步证据，并为POCT定量检测技术的更广泛推广提供了宝贵经验。